贴壁 vs. 悬浮平台：病毒载体生产的未来是什么？
本文节选自AGC Biologics细胞与基因治疗全球主管Ramin Baghirzade发表的文章“Adherent versus suspension based platforms: what is the near future of viral vector manufacturing？”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
托尔斯泰的作品《安娜·卡列尼娜》的第一句话就是这样开头的:“幸福的家庭都是相似的；每个不幸的家庭各有各的不幸。”这一概念以“安娜·卡列尼娜原则”的形式得到普及，并应用于多个科学和社会学科中。它表明，成功的努力都有一系列共同的主要特征，而如果其中任何一个关键特征有缺陷，就会有许多通向不幸的道路。套用托尔斯泰的说法，虽然成功的生产平台都是相似的(比如在滴度和产量方面)，但每个不成功的生产平台都有其自身的缺陷。
在全球范围内，细胞和基因治疗的临床试验已经超过1200项，随着晚期管线的成熟和即将到来的商业化浪潮，该领域正达到一个拐点。目前，有超过三分之二的临床试验处于2期/ 3期阶段。根据一个经常被引用的数字，FDA预测到2025年，每年将批准10-20个细胞和基因治疗产品，同时，每年将有超过200个IND申报。
随着该领域的成熟，对病毒载体生产的需求也在提高，特别是慢病毒(LV)和腺相关病毒(AAV)的生产，这两种主要载体用于体外和体内基因治疗。在寻求一个成功的生产平台的同时，治疗药物开发商的最终目标是使生产过程具有商业可行性。商业可行性与监管机构可接受的申报生产工艺质量和从商业角度看合理的每个患者病毒成本(占总COGS的百分比)有关。后一个方面与工艺可放大性密切相关。
在解决商业可行性的问题时，治疗药物开发商面临一个关键的问题是：你选择基于贴壁还是悬浮的病毒载体生产工艺？本文总结了每种方法的优缺点，而结论是，两者都会有一席之地。
基于贴壁平台的现状：
在行业中占据主导地位，至少对于某些产品的商业化来说已经“足够好”，因为对其来说，不会让追求完美成为项目发展的“敌人”
在生物学中，在培养中生长细胞的两种方法可以加以区分：即贴壁法和悬浮法。在贴壁细胞培养中，细胞以单层形式附着在基质上生长。在悬浮细胞培养中，细胞在培养基中自由漂浮。目前，贴壁细胞培养被用于生产大约70%的病毒载体产品。AAV和LVV载体生产最常见的方式是使用贴壁的人胚胎HEK293细胞。通常，人胚胎HEK293细胞或HEK293源性293T细胞使用载体结构 (包含GOI)和辅助/包装质粒转染。
传统使用的贴壁培养系统单元包括滚瓶、烧瓶、康宁的HYPERStacks®和Thermo Fischer的Nunc™Cell Factory™系统。依靠2D贴壁塑料制品平台作为上游生产的起始选择，从至少3个角度来看很容易理解：
它们很容易以现货形式买到 它们比较容易在实验室规模条件下培养 与3D平台相比，它们需要较少的生物工程专业知识
此外，基本的贴壁培养系统单元仅需要较低的前期资本投入，因此是(早期)研究目的应用的比较实际起点。沉重的资本支出几乎不是优先考虑的事情，也不是一个好的选择，比如说，对于一个学术机构或一家新成立的大学分拆公司来说。考虑到细胞和基因疗法的创新大多来自较小规模的生物技术公司，细胞和基因疗法的开发商继承了在学术界开发和/或授权的工艺。
可能被良好记录的、基于贴壁工艺的上市产品例子之一是Luxturna® (voretigene neparvovec)，它使用AAV2将RPE65基因的功能性拷贝递送进入视网膜色素上皮(RPE)细胞。该产品由Spark Therapeutics(现为罗氏子公司)开发，并于2017年12月获得FDA批准。Luxturna的AAV上游生产工艺依赖于滚瓶 - 基本的2D细胞培养系统，使用贴壁HEK 293细胞工艺。这里使用经典的“规模扩展”方法 – 提高生产产量的唯一方法是增加更多的滚瓶 - 而不是提高容器的体积(“规模放大”)，而后者将是基于悬浮的工艺的选择。Diane Blumenthal，当时(2019年)是Spark的技术运营主管，主张“不要让追求完美成为进步的敌人”的原则。显然，使贴壁平台可行的是所需的剂量相对较低(视网膜下注射)且目标患者人数相对较少。
另一个使用基于贴壁的方法而进入市场的例子是Zolgensma® (onasemnogene abevovecc -xioi)，基于AAV9的基因疗法，用于治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)。该产品由AveXis(现为诺华子公司)开发，于2019年5月获得FDA批准。Zolgensma的AAV上游生产工艺依赖于iCELLis®固定床生物反应器(FBR)贴壁平台。iCELLis FBR平台已被引用为贴壁细胞培养“最具成本效益的选择”，并已被用作商业上可行的解决方案，而无需切换到悬浮平台。有大量的数据可以证明如何在不改变产品关键质量属性(CQA)的情况下，将一个基于48L细胞工厂的工艺放大到200L iCELLis® FBR。
除了已经商业化的Luxturna和Zolgensma，另有一些开发商明确决定打算在贴壁平台上商业化部分管线，而另一部分采用悬浮平台，或逐步过渡到悬浮。值得注意的是，作为基因治疗的先驱之一，Bluebird Bio在2013年提交给美国证券交易委员会（SEC）的文件中明确指出，他们打算使用贴壁平台“继续制造”其Lenti-D载体 (SKYSONA™，于2021年7月获得EMA批准)。同时将其Lenti-Globin (ZYNTEGLO™- 2019年6月经欧盟委员会有条件批准)载体驯化至悬浮生产。有趣的是，在2020年提交给美国证券交易委员会(SEC)的文件中，BMS披露，它将idec-cel (ABECMA®，一种CAR-T产品，于2021年3月获得FDA批准)的合同生产协议外包给了一个贴壁平台，但“随着时间的推移”，生产将以悬浮方式进行。
基于悬浮平台的现状：
已在传统生物药中得到广泛应用，在细胞和基因治疗行业仍处于早期阶段，虽然被认为是某些类型产品/适应症的“必须”选择。
贴壁生产模式通常意味着如要增加生产产量，就必须“规模扩展”，而不是“规模放大” - 这在传统生物药中已经很好地建立起来了，而且通常(虽然不是唯一的)与搅拌罐生物反应器(STR)相关。
经常被提到的基本2D上游生产单元的局限性包括规模选择有限 - 这可能会使生产成本高得令人望而却步，以及批次间的一致性，这可能会带来监管挑战。基于贴壁的生产工艺也倾向于使用胎牛血清(FBS)，这可能会带来安全性、一致性和最终的监管挑战。另一方面，转换到无血清、悬浮平台并不总是一个可行的解决方案，也不是一种没有失败可能性的尝试。然而，例如，HEK293细胞已经可被驯化在悬浮培养体系中生长，并且也有其它基于悬浮的细胞系，虽然这些细胞系也不是没有它们本身的挑战 – 如在病毒载体的时间线、成本、数量和质量方面。此外，由于“产品就是工艺”，转换工艺可能意味着产品不再相同，可能需要进行桥接/可比性研究。治疗药物开发人员经常面临的一个两难问题是，现有的(贴壁)工艺是否“足够好”，适合商业化，他们愿意或能够等待或投资多少，以尝试切换到悬浮平台。
也许关于已上市的、基于悬浮工艺的治疗药物的最好案例之一是UniQure推出的基于AAV1的产品Glybera，它被称为西方世界的“第一个基因疗法”。该药物于2012年10月被EMA批准用于治疗遗传性脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)。在2005年的临床前研究和首次临床试验中使用贴壁的HEK293工艺，但由于需要更多的载体，HEK293平台被改为基于悬浮培养的杆状病毒生产系统。NIH的科学家通过用三种不同的杆状病毒感染Spodoptera frugiperda (Sf9)昆虫细胞，首次证明了这种方法的适用性，前者既可以作为辅助病毒，也可以作为AAV遗传物质的载体。基于杆状病毒的生产平台也不是没有自己的挑战。例如，在Glybera的案例中，虽然切换平台有助于生产更多的载体，但EMA的评估报告认为杂质水平“高得无法接受”。值得注意的是，杆状病毒DNA被强调为一个“主要问题”，并要求治疗药物开发商进行详细的风险评估。此外，还需要对基于质粒的HEK293贴壁工艺和基于悬浮杆状病毒的平台进行可比性研究。
在Glybera的案例中，与转向悬浮相关的挑战似乎仍然取得了成效 - 尽管该产品在2017年自愿退出了市场。根据适应症/剂量/所需的载体数量，治疗药物开发商可能会觉得有义务选择悬浮系统，作为唯一可持续的选择。例如，在评估肌肉疾病的病毒载体需求时，Salabarria等人得出结论是，对于规模超过1-5E +10^15 vg的AAV生产，贴壁平台“根本不可行”，因此不适合这些适应症的晚期/商业应用。对于这些特殊情况，建议使用替代的基于悬浮的方法，例如适应悬浮培养的HEK293，基于感染的平台(例如使用杆状病毒)，或稳定生产细胞系，以使上游规模达到500L或更高。与此类似，辉瑞宣布将AAV上游生产提高到2000L，以支持其治疗杜兴式肌营养不良症(DMD)的AAV9晚期试验。
然而，正如文章前面所述，固定床生物反应器已经被评估为贴壁培养的“最具成本效益”的解决方案，同样的研究发现基于悬浮的STR生产是最具成本效益的技术，“当悬浮驯化的细胞系可用时”。悬浮驯化细胞系的可用性，及其表征，是一个关键的限定因素。例如，正如在其它地方所争论的那样，悬浮培养中的生产细胞系优于瞬时转染方法 – 特别是当涉及到成本、再现性和可放大性时，尽管开发工作可能“繁琐”且耗时，且无法保证成功。
虽然有基于悬浮培养而成功进行生产的例子，包括从贴壁工艺成功驯化至悬浮培养，在我在该行业的职业生涯中，我也遇到了许多案例，治疗药物开发商尝试切换到悬浮培养，但却失败了，转而把精力集中在优化贴壁工艺上。虽然这种情况并不少见，但开发商并不愿意公开宣传自己的失败。
结语：没有灵丹妙药
很明显，贴壁或悬浮生产方法都存在相关的挑战。同样明显的是，贴壁生产模式在某些情况下是可行的解决方案，而在其它情况下则不是。与此同时，悬浮生产虽然在某些情况下被视为是“必须”的，但可能并不总是正确的做法。没有什么灵丹妙药，生产策略必须根据具体情况进行评估。随着开发商将细胞和基因疗法推向市场，他们往往会在多种有时相互冲突的困境中挣扎，包括：
这种生产工艺是否“足够好”，可以在特定的疾病适应症中帮助实现商业化？ 要使工艺具有商业可行性，需要进行多少工艺开发/优化工作？ 上市速度和开发生产工艺的时间之间的最佳权衡是什么？ 在什么时候(如果有的话)切换到悬浮是明智的：在获批上市之前还是之后？(对于所有相关的影响 - 例如，可比性/桥接研究)。 如果基于悬浮的工艺不是最优的，应该选择贴壁工艺还是继续投资开发悬浮工艺？ 应该选择哪种类型的悬浮工艺？(如HEK293瞬时转染、共感染、稳定产生细胞系)
在这些和其它困境中挣扎的同时，重要的是，治疗药物开发商不要被哺乳动物偏见所左右- 因为有时，少即是多。根据工艺效率 (总转导单位(TU)或vg/批次)，一个48L的贴壁平台可能比一个200L的悬浮STR能够治疗更多的患者。
原文：R.Baghirzade, Adherent versus suspension based platforms: what is the near future of viral vector manufacturing? Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(11), 1365–1371.
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