用于腺相关病毒载体纯化的不同液相层析策略的比较
本文为“Comparison of Different Liquid Chromatography-Based Purification Strategies for Adeno-Associated Virus Vectors”内容简介，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
摘要：重组腺相关病毒(rAAV)载体由于其良好的安全性、高转导效率以及在非分裂细胞中的长期基因表达，已成为最有应用前景的基因治疗技术之一。基于rAAV的基因疗法在治疗遗传性疾病，如遗传性失明、肌肉萎缩或出血疾病方面，有着巨大的前景。目前，行业对高效、可放大的rAAV生产和纯化方法有很高的需求。对于下游的纯化方法尤其如此。目前的标准方法是基于多步梯度超速离心，其允许对完整rAAV颗粒进行纯化和富集，但这种方法的规模放大具有不小的挑战性。这里，我们实验探索了快速、可放大且通用的基于液相层析的rAAV纯化策略。与可能导致大量AAV损失的疏水作用层析(HIC)相比，阳离子交换层析(CEX)可对多种测试的血清型进行稳健的纯化，获得具有良好纯度特性的完整和空rAAV混合物。对于测试的亲和层析(AC)，实验观察到其效果与血清型有关。阴离子交换层析(AEX)对AAV8血清型有效，可实现高水平的纯化，并可对完整rAAV和空rAAV进行基线分离。根据AAV血清型的不同，推荐使用CEX和AEX或AC和AEX的组合，这在未来需要高纯度和完整颗粒富集的rAAV转化项目上，具有良好的应用前景。
简介
重组腺相关病毒(rAAV)载体已经成为一种非常有前途的基因递送工具，并已在190多种针对不同适应症的临床试验中使用，具有非常好的安全性。目前有多种不同免疫特性的AAV血清型正在使用中；然而，基于2型血清型的rAAV(AAV 2)在临床前研究中得到了最广泛的评估，因为这是第一个完全表征的血清型。目前，行业对可放大的商业化生产和纯化方法的需求越来越大。rAAV的生产工艺由三个阶段组成：(i)上游阶段，包括rAAV的生产；(ii)下游阶段，涉及AAV的纯化；(iii) 制剂和灌装工艺，确保最佳的稳定性以及给药所需的治疗剂量。这里，我们重点介绍下游纯化工艺。
在过去的20年里，已经建立了许多rAAV载体的纯化方案。下游纯化工艺旨在去除工艺相关杂质，如宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA和工艺添加物，以及产物相关杂质，如聚集的载体和空衣壳，这些都是在上游工艺中产生的。rAAV载体的一种纯化方法是氯化铯（CsCl）或碘克沙醇梯度超速离心法，使用该方法纯化的物料已在多个临床试验中使用。梯度超速离心法的主要优点是使用时的灵活性以及仅需要较少的调整，即可有效地纯化不同的AAV血清型，并能从空颗粒中分离出完整的rAAV。然而，梯度超速离心方法通常局限于几百微升的产物体积，不容易规模放大，而且难以在GMP环境下运行。相比之下，基于液相层析的纯化方法提供了具有良好可放大性的替代方法，使rAAV的生产获得所需的高纯度、效力和一致性。然而，层析填料和层析条件通常需要针对每种血清型“量身定制”，且高效去除载体相关杂质(如空衣壳)仍是一个挑战。已经有文章讨论了空衣壳对效力和免疫原性的影响，因此，需要有效去除它们的方案，对于这一点，目前有多个小组和公司正在探索适用的方案。这里，我们提供液相层析柱纯化AAV2/8的数据，并比较亲和层析(AC)、疏水作用层析(HIC)和阳离子交换层析(CEX)的效果，然后，对于两种产品，都使用阴离子交换层析(AEX)从空衣壳中分离完整衣壳。在AEX方法开发中，我们能够实现载基因组衣壳和空衣壳之间的基线分离。
AC和CEX的方案也可应用于AAV2的纯化，并得到相似的纯化水平。
图1. 5种纯化和分离空以及完整重组腺相关病毒(rAAV)的方法的概况。在每个实验中，只进行第一个箭头中提到的一种收获方法。右边的简写指示纯化过程，后文中使用相同的标示。
切向流过滤：对于部分rAAV载体批次，细胞培养上清液使用切向流过滤方法收获、过滤和浓缩。实验使用Repligen的KrosFlo KR2i 系统以及MWCO 100 kD的mPES 中空纤维过滤组件进行。
详细的实验方法和结果，请参考原文。
讨论
这里，我们探索了不同的液相层析方法来纯化来自细胞培养上清液或细胞颗粒裂解液的rAAV物料。下表总结了主要的研究结果。在初步的评估中，我们选择了以广泛使用且易于生产的AAV8血清型假型的rAAV。
基于超速离心和不同液相层析的rAAV纯化策略比较
HIC-CEX-AEX工艺包括在HIC、CEX和AEX层析柱上的三个连续层析步骤，并可始终一致地从细胞培养上清液中高产量、高纯度地生产rAAV2/8物料，该工艺以TFF进行初步缓冲液置换。然而，当使用细胞培养上清液PEG沉淀或细胞颗粒裂解液时，rAAV载体有大量的损失 (表1)，对不同层析步骤的收率进行分析显示，损失主要发生在HIC阶段。所观察到的结果的确切原因尚不清楚。但容易推测的是，初始的TFF步骤有助于去除对HIC步骤产生负面影响的杂质。因此，如果不结合初始的TFF步骤，HIC-CEX-AEX工艺会导致纯化工艺结束时的低收率，因此必须进行更改。事实上，在CEX-AEX工艺中去除这一HIC步骤，两种物料的收率都有所增加，而这两种物料在HIC-CEX-AEX工艺中的效率却较低。重要的是，在本研究中测试的CEX层析柱在所有测试rAAV上都获得了良好的结果。仅在rAAV2/8中，由于只能在清洗步骤中洗脱，因此大量rAAV残留在层析柱上，最终损失。
进一步优化程序，例如，通过调整缓冲液pH从4.0到pH4.5或pH 5.0，以降低与层析柱的结合，可能有助于增加rAAV2/8在层析洗脱部分中可回收的馏分。值得注意的是，正如最近一项研究所显示的，长时间处于低pH会损害衣壳。因此，提高pH值，以优化与CEX层析柱的结合，也有利于rAAV的稳定性，但超出了此研究工作的范围。
在AC-AEX工艺中，我们探索了POROS AAVx亲和柱作为CEX替代的方案。最近的一项研究显示，AAVx层析柱对广泛的天然和合成血清型具有较高的静态结合回收率(>95%)。对于以自然发生的AAV血清型AAV8或AAV2假型的rAAV，我们可以证实这一结果，并实现了两者相似的收率。然而，对于最近研究的两种AAV2变体的纯化，AC层析柱的亲和力和收率大大降低，大量rAAV在流穿馏分中损失。这些AAV2变体包括AAV2.GL和AAV2.NN，在其AAV衣壳表面暴露的高可变环IV中携带肽插入，这似乎影响了衣壳有效结合亲和基质的能力。虽然AC层析柱的制造商没有披露亲和基质的确切组成，但似乎由高可变环IV组成的结构或序列表位确实对结合亲和性有很大的影响。
除了所需的装载载体基因组的“完整”rAAV，所有的rAAV生产方法都会产生不同数量的无基因组“衣壳”空颗粒副产品。因此，HIC-CEX-AEX和AC-AEX工艺均包含了最后的AEX步骤，以便从空衣壳中分离出完整的rAAV。DNA的包装被认为会引起衣壳结构的微小变化和颗粒总电荷的变化。事实上，据报道，空衣壳的IEP约为6.3，而完整rAAV的IEP约为5.9。结合pH高于IEP的运行缓冲液，可以利用AEX层析分离这两种物质。
首先，我们在HIC-CEX-AEX和AC-AEX下游工艺中使用CIMmultus QA柱进行AEX层析。该层析柱没有实现完整和空衣壳峰的基线分离，但仍然获得了完整rAAV的富集。随后，我们对CIMmultus PrimaS (AAV)层析柱进行了测试，发现完整和空衣壳色谱峰获得了更好的分离。特别是，当我们对缓冲液B使用步进方案时，我们几乎实现了完整rAAV和空衣壳峰的基线分离。其它研究也通过AEX实现了对不同AAV血清型的完整/空衣壳的分离。为了确定从空衣壳中完全分离rAAV的程度，我们使用了分析型AEX。为了验证分析型AEX的结果，我们使用SV-AUC作为正交方法。虽然相比260和280nm，230nm处的SV-AUC分析的灵敏度更高，但只比较了吸光度超过0.15 OD单位的中、高浓度rAAV制剂。AUC被用于空衣壳馏分，并确认了非常高的纯度99% (相比之下，分析型AEX确定为100%)。SV-AUC定量的完整rAAV馏分中一起洗脱的空衣壳的比例定量为17%，而AEX对空衣壳的定量值略低，为12%。SV-AUC对完整和混合rAAV馏分的检测结果也显示了部分包装和聚集rAAV的水平，这是AEX无法观察到的。
除了空衣壳，其它杂质也很重要。在这方面，我们发现，与通过PEG沉淀法或TFF法从细胞培养上清中获得的rAAV相比，来自细胞颗粒裂解液的rAAV物料最终具有略高的HEK细胞DNA。TFF缓冲液置换的初始步骤直接去除了一些工艺相关杂质，而PEG沉淀在去除工艺相关杂质方面也同样有效。然而，正如在银染SDS-PAGE中所看到的，这两步都没法完全去除杂质，仍然会产生额外的条带。通过HIC、CEX或AC，可以获得更好的纯化效果。额外的AEX步骤不仅有助于去除空的AAV衣壳，还进一步降低了HEK细胞DNA的含量。有趣的是，AEX步骤从空衣壳馏分去除HEK细胞DNA的效率甚至比从完整的rAAV馏分去除更高。其确切原因尚不清楚，但可能与完整rAAV在AEX柱的梯度中洗脱更晚有关。由于DNA与AEX柱结合强烈，DNA污染物在梯度中洗脱较晚，这与完整rAAV的洗脱更接近。
当使用不同的起始物料时，需要考虑的另一点是，从上清液或细胞颗粒中获得的AAV衣壳的翻译后修饰(PTM)模式的潜在差异。这种差异可能会影响生产工艺或产物的特性。事实上，已经有研究鉴定了AAV衣壳的各种PTM，并讨论了其对rAAV载体功能的潜在影响。PTM模式是否以及如何影响rAAV的层析纯化需要在未来的研究中明确。
到目前为止，纯化rAAV的金标准是使用氯化铯或碘克沙醇梯度超速离心法。除了去除杂质，这种方案，特别是在执行两个(或更多)连续的超速离心步骤时，能够有效地从空AAV衣壳中分离出完整的rAAV载体。基于超速离心法的方案的缺点是可放大性差，且对操作人员有较高的依赖，这可能导致批次之间的高变异性。因此，将超速离心法用于rAAV的大规模商业化生产具有不小的挑战性。不过，这些方法经常用于基础研究应用和临床前体内研究，可以考虑经过一些优化后用于GMP工艺，特别是对于仅需局部给药的适应症，其载体用量较小，通常不需要大规模地制造大量的rAAV载体。
除了梯度超速离心法之外，我们测试的所有层析步骤都易于放大。AC具有很高的选择性，对rAAV2/8的初始vg数量有60-80%的收率，但AC不区分完整和空衣壳，而且vg收率取决于血清型 -特别是，含有工程AAV衣壳的载体使用这种类型的层析柱时会有一些问题。与AC相比，CEX可用于所有测试的rAAV，收率约为70-80%。另一方面，CEX无法从具有相似pI的蛋白质杂质中区分组装好的衣壳，因此，通常需要使用具有不同pH和盐条件的其它基质进行后续步骤。然而，AC和CEX都不能去除固有的空衣壳副产物，这需要额外的AEX步骤，在最佳条件下，其可以实现完整和空rAAV的基线分离。值得注意的是，通过将CEX与AEX层析柱相结合，可以解决上述问题，并去除蛋白质杂质。
总结
综上所述，我们对不同的层析纯化方法进行了比较，这些方法可以有效地去除工艺相关杂质，并从空衣壳中分离出完整的rAAV，且收率较高。不同方案对不同血清型表现出了不同的性能。因此，我们的结果可以用于未来针对特定的衣壳类型，细化和调整层析方案。根据AAV血清型的不同，建议联合使用CEX和AEX或AC和AEX。完整和空rAAV分离效果特别好，且对常用的AAV8血清型实现了高水平的纯化。我们的发现为未来需要高度纯化和充分颗粒富集rAAV制备的转化项目提供了希望。
原文：R.Rieser, J.Koch, G.Faccioli, et al., Comparison of Different Liquid Chromatography-Based Purification Strategies for Adeno-Associated Virus Vectors. Pharmaceutics 2021,13, 748.
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