γ-逆转录病毒和慢病毒载体生产 - I
本文节选自《Gammaretroviral and lentiviral vector manufacture: brief overview》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
病毒载体系统
源于病毒的载体系统作为基因递送工具已经在基因和细胞治疗领域应用了多年。已经有多种类型的病毒载体类型可以选择使用，其中，基因和细胞治疗领域最常使用的是慢病毒（LV）、γ-逆转录病毒（GRV）、腺病毒（AV）以及腺相关病毒（AAV）。分别源于小鼠白血病病毒和HIV的γ-逆转录病毒载体（GRVV）和慢病毒载体（LVV）是最常使用的两种逆转录病毒。针对特定的应用选择病毒载体系统时需要考虑的主要因素包括治疗性GOI（目的基因）的负载量（插入大小）、免疫原性、细胞趋向性和被靶细胞摄取的效率、基因表达的持续时间以及规模化生产的简单性。Thomas等曾总结介绍过不同的病毒载体系统，整合 vs 非整合、囊膜 vs 无囊膜、病毒DNA基因组 vs 病毒RNA。此外，Patel等强调过每种系统的优势和劣势，每种载体系统从其各自的特性来说都是独一无二的，这也使其可能适合某些应用，而不适合另一些应用。
治疗性基因表达的持久性是针对应用需求选择病毒载体的关键考虑因素。病毒载体可分为整合型和非整合型两大类。γ-逆转录病毒和慢病毒载体都是带有RNA基因组的逆转录病毒，其在分裂细胞中整合并通常会导致GOI的持续表达，而AAV和腺病毒是非整合型DNA病毒，在分裂细胞中形成瞬时表达。γ - 逆转录病毒载体和慢病毒载体的另一个优点是它们的基因插入容量约为9 kb。本文不讨论非整合病毒载体。本文的重点是整合型逆转录病毒载体GRVV和LVV。
整合型病毒载体：逆转录病毒
逆转录病毒是含有单链RNA基因组双拷贝的囊膜RNA病毒。囊膜在决定宿主细胞(HC)特异性方面起着非常重要的作用。囊膜蛋白通过直接的膜融合或由囊膜糖蛋白与宿主靶细胞上的同源受体结合而促进的受体介导内吞作用，帮助细胞进入。
逆转录病毒载体是基因治疗和细胞治疗的热门选择，因为它可以通过整合到宿主细胞基因组中，而实现长期稳定的基因表达。然而，整合也存在风险，整合可能导致插入突变，致使原癌基因上调，使宿主细胞发生恶性转化。γ-逆转录病毒载体(GRVV)倾向于在接近基因调节的区域整合，如转录起始位点，这比倾向于整合到基因本体中的慢病毒载体具有更高的遗传毒性风险。γ-逆转录病毒载体与慢病毒载体的另一个主要区别是，γ-逆转录病毒载体优先转导分裂细胞，不能转导非分裂细胞，而慢病毒载体既可以转导分裂细胞，也可以转导非分裂细胞。γ-逆转录病毒载体具有简单的基因组结构，由以下蛋白质编码基因组成：gag、pol和env。Gag编码衣壳蛋白，Pol编码病毒酶 (逆转录酶、整合酶和蛋白酶)，Env编码囊膜蛋白。慢病毒载体有更复杂的基因组。除了gag、pol和env，HIV基因组还编码6个额外的蛋白质：2个调节蛋白Rev和Tat以及4个辅助蛋白Vpr、Vpu、Vif和Nef。
为了缓解与野生型逆转录病毒的致病性相关的不良影响和其它潜在的有害影响，逆转录病毒载体已经通过将病毒基因组减少到只有有效包装成病毒颗粒所需的基本遗传元素而变得更安全。除了删除不必要的遗传元件使病毒载体更安全，同时对病毒基因组进行了分割，并以反式形式提供包装基因组，后者通过用于生成稳定载体生产细胞系的包装系统细胞系或用于病毒载体瞬时生产的不同质粒。这降低了重组的机会，使病毒载体无复制能力，从而提高了安全性。
病毒天然的囊膜也置换为来自其它病毒的囊膜，如水疱性口炎病毒(VSV-G)囊膜的糖蛋白，这是一种最常用于慢病毒、长猿白血病病毒(GALV)、猫内源性逆转录病毒(RD114)、亲嗜性(鼠白血病病毒)、兼嗜性(鼠白血病病毒)和异嗜性(鼠白血病病毒)的泛嗜性囊膜。当病毒载体作为基因递送载体被开发时，每一次修饰都会产生新一代的病毒基因组，不断地分裂并分离以增加反式提供的病毒基因数量。这种分离包装基因设计最大限度地减少了重组形成具有复制能力的病毒颗粒的可能性，从而使其可以更安全地用于临床。快速生产γ-逆转录病毒载体的常用方法是3质粒系统，其中，病毒基因组别分裂为3种形式。递送载体包含逆转录病毒基因组的长末端重复序列(LTRs)、包装信号Ψ和多嘌呤序列(PPT)以及GOI。包装gag/pol和囊膜基因由其它两个质粒反式提供。囊膜决定了病毒载体的假型，其根据靶细胞选择，来自于不同的病毒。
第三代更复杂的慢病毒载体由4质粒系统组成，其中去掉了Vpr、Vpu、Vif和Nef四个辅助蛋白，并将载体基因组减少到只编码9个HIV蛋白中的3个，使其可安全地用作基因递送载体。此外，3个HIV基因和囊膜 (来自不同的物种) 被分裂为：
含有来自病毒基因组的LTR、包装信号Ψ、Rev响应元件（RRE）和PPT以及GOI的递送载体
Rev调节元件
Gag/Pol包装质粒，以及
囊膜质粒
目前，已经开发了第四代慢病毒载体系统，其将病毒基因组进一步分裂为五质粒系统，已有公司可提供此产品，如Takara Bio和Dharmacon。但是，这种方法需要更多的质粒，可能会降低转染的效率。此外，通过密码子优化进一步降低了转移质粒和包装质粒之间的同源性，但这导致了病毒滴度的降低。Berkhout等人重新设计了转移质粒，将病毒顺式作用元件置于3' LTR下游，使这些元件不会被整合到宿主细胞基因组中，从而使载体系统更安全。然而，第四代慢病毒载体系统需要更多的开发工作，使其成为与第三代系统一样高效的基因传递工具。
第一个被批准的基因治疗载体是用于SCID-X1(人类严重联合免疫缺陷X-连锁) 患者的Moloney小鼠白血病病毒 (MLV) γ - 逆转录病毒载体。在FDA目前批准的五种CAR-T产品(Yescarta®，Kymriah®，Tecartus™，Breyanzi®和Abecma™)中，有两种使用γ-逆转录病毒载体，三种使用慢病毒载体。慢病毒和γ-逆转录病毒载体是最有吸引力的基因传递系统，因其免疫原性低和转导效率高。
逆转录病毒载体的生产工艺
γ-逆转录病毒和慢病毒载体有两个主要的生产平台：
瞬时工艺，包括将质粒(多个或单个)转染到适当的细胞系中，以及稳定工艺，即以表达包装和囊膜基因的包装细胞系制备产生病毒载体的稳定细胞系。
在选择生产平台时要考虑的重点是项目所处的阶段。在早期阶段，即研究和开发阶段，首选瞬时工艺，因为它更快、更容易实现。使用瞬态平台，可以在选择最终结构之前同时测试多个病毒结构的功能。一旦确定了项目的载体结构，就可以开始使用所选择的载体结构生成稳定的病毒载体产生细胞系。制备符合cGMP要求的主细胞库(MCB)需要大约一年的时间，但一个稳定的载体生产细胞系将使用于临床和商业目的的载体的生产更加容易。
通常，在研究和开发的早期，进行小规模生产，在这一阶段，进行工艺优化研究，以提高载体的产量和质量。同时，在这一阶段，可以使用没有非常严格质量要求的研究级材料和试剂。随着项目从研发阶段过渡到临床前、临床和商用化阶段，不仅生产规模增加 (可能需要额外的工艺优化)，而且需要GMP级试剂、细胞株和质粒，以满足监管机构发布的严格质量和监管要求。因此，成本将增加，也就是说，为了实现经济高效的病毒载体生产，在确定最佳的生产技术时，必需将成本因素考虑在内。
瞬时平台和稳定平台的生产过程可以分为上游和下游两个阶段。上游工艺以一个合适的细胞系生产病毒载体，并获得大量的病毒上清液。下游工艺包括用于去除工艺和产品相关杂质的纯化步骤，以及获得纯化、有效病毒载体的浓缩步骤，以实现基因递送的有效性。
表1. 不同生产平台的优点和缺点：稳定 vs 瞬时
优势 | 缺点 | |
瞬时系统 | 灵活 – 在研发过程中，可在小规模条件下，同时测试多种基因 没有制备细胞系的时间 | 可放大性 批次间的差异性 杂质：质粒和转染试剂 质粒和转染试剂的成本 |
稳定系统 | 可放大性：规模放大更简单 单个生产运行产量更高：病毒收获原液的量更高 更高的批次间一致性 由于不使用质粒和转染试剂，病毒收获液更“干净” | 制备稳定生产细胞系需要较长的时间 制备cGMP合规主细胞库MCB的成本和时间 |
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原文：R.Sengupta, Gammaretroviral and lentiviral vector manufacture: brief overview. Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(3), 345–354.
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