慢病毒：以切向流过滤进行浓缩和缓冲液置换
本文节选自《Lentiviral Vector Bioprocessing》，详细内容，请参考原文。
切向流过滤(TFF)是一种通常以超滤/洗滤 (UF/DF) 模式运行的单元操作，除了去除低分子量杂质，截留载体颗粒，还允许在LV工艺过程中降低料液体积，并置换缓冲液。切向流过滤可使用不同的形式（表1）按不同的参数（表2）进行。操作过程中，切向超滤允许降低体积，将载体浓缩到适当的滴度，并通过降低料液体积而简化下游工艺。浓缩步骤之后，通常还需进行缓冲液置换 (洗滤) 操作，以获得最佳的缓冲液置换消耗率。载体可置换的缓冲液的选择对于保持载体在一段时间内和在冻融期间的稳定性至关重要，对于置换成最佳的层析结合缓冲液或针对受体细胞的有效转导亦是如此。除了TFF之外，浓缩和换液也可以通过多轮离心并以所选缓冲液重悬或SEC方法来完成。然而，TFF提供了更大的“自主性”，并可减少手动操作，同时保持高载体浓度。
表1. 慢病毒载体工艺中切向流过滤操作和膜材质选择示例
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表2. 慢病毒载体工艺中切向流过滤操作条件示例
一些TFF系统使用中空纤维单元，而另一些则使用膜包，膜可采用不同的材质，如纤维素 (例如，混合纤维素酯) 以及聚醚砜 (PES)。这两种形式都是载体浓缩和缓冲液置换的可放大和适用解决方案。这两种形式都提供了高表面积和体积比，尽管平板膜包可能可以提供比中空纤维更高的通量，但这是以对载体颗粒更高的剪切率为代价的，后者主要源于膜包内部“迂回”的流路和湍流促进筛网。
TFF中的膜根据其截留级别 (通常以kDa为单位)，可允许盐、缓冲液和小分子物种跨膜转移。TFF的澄清效率与进样和各组分的截留系数有关。一些研究小组将TFF用于澄清和纯化步骤，作为层析的替代方法，获得了达97%的回收率，或与超速离心结合时，浓缩倍数可达1,800倍。因此，TFF可以应用在多个步骤中，如在层析后，以从洗脱缓冲液中去除过量的盐，缓冲液置换为制剂缓冲液，或者置换为层析中用于捕获的最佳结合缓冲液，又或者在SEC前进行浓缩。此外，如果需要对载体的生产进行强化，可以使用中空纤维膜进行串联过滤，以在膜表面积不断降低的连续中空纤维内浓缩产物，或者使用单通过（Single-Pass）切向流过滤，即料液不循环，进样料液沿长而迂回的膜路径流动。尽管截至本文撰写时，还没有将单通过切向流过滤应用于慢病毒的文章发表，但单通过切向流过滤已被用于单克隆抗体和重组蛋白的生产。随着工艺的成熟，这种单元操作的实施是有可能的，特别是基于灌流的生物反应器和稳定生产细胞系的发展允许进行连续生产时。
尽管如此，TFF的参数需要根据进样料液进行优化，因为流速和过滤器及膜类型的选择会导致剪切损伤和载体损失。此外，由于跨膜压、进料流速和进料成分的影响膜污染的发生，继而影响通量，这可能导致工艺时间延长，即可能需要更大的膜，而这会导致更高的滞留体积。载体也可能吸附或被“困”在膜表面，尤其是在孔径与载体大小接近的情况下，尽管更大的膜孔可以更好地去除杂质，并获得更高的通量。因此，通常采用100- 750 kDa范围内的膜。较大的孔径有利于提高通量，但可能导致载体损失，而较低的截留孔径可能会导致较低的通量，但有利于维持载体收率。运行后进行冲洗可以帮助“释放”膜上吸附的载体，但优化取决于这一阶段的进样料液状态。此外，进样料液中的添加剂，如蔗糖或类似的增粘剂，可以保护载体，降低剪切的影响。
原文：C.Perry, A.C.M.E.Rayat, Lentiviral Vector Bioprocessing. Viruses, 2021, 13, 268.
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