γ-逆转录病毒和慢病毒载体生产 - II
本文节选自《Gammaretroviral and lentiviral vector manufacture: brief overview》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。更多内容，也可查看往期文章“γ-逆转录病毒和慢病毒载体生产 - I”。
上游工艺
上游工艺始于在培养系统中生长和扩增的特定生产细胞系。这些细胞可以在悬浮系统 (如摇瓶、生物反应器)或贴壁系统(如组织培养瓶、细胞工厂、滚瓶和固定床生物反应器)中生长。贴壁细胞在含有血清的培养基中生长，而悬浮细胞可适应在无血清培养基中生长。
γ-逆转录病毒和慢病毒载体主要使用HEK293细胞和293衍生细胞如293T细胞生产。γ-逆转录病毒载体也可以从NIH-3T3衍生的PG13细胞中获得。Yescarta®是FDA批准的用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病的CAR-T细胞治疗产品之一，其使用稳定的γ-逆转录病毒载体生产NIH-3T3细胞系。
使用包括携带GOI基因的转移质粒、携带Gag/Pol包装基因的包装质粒和囊膜质粒的三质粒系统转入细胞系，可瞬时合成γ-逆转录病毒载体(MLV)。或由一单个质粒(转移质粒)转染至稳定表达gag-pol和env的包装细胞系，如兼嗜性和亲嗜性细胞系(Cell Biolabs)、293VEC细胞系(BioVec Pharma) 或PG13细胞系(ATCC)，消除了以特定质粒反式递送包装基因的需求。
使用单质粒转染可简化上游工艺，此外，还可降低产品成本，主要是质粒成本，继而降低供应链风险。
对于慢病毒载体，临床应用通常使用第三代慢病毒载体，其涉及4质粒转染，即将携带GOI的转移载体、Gag/Pol包装质粒、Rev辅助质粒以及囊膜质粒转入合适的细胞系（如293T细胞）。
对于瞬时系统，质粒使用转染试剂转染，如lipofectamine、磷酸钙、聚乙烯亚胺(PEI)。对于细胞生长于贴壁系统，如细胞工厂或培养瓶，的瞬时系统，通常需在转染后24小时更换培养基，以去除毒性转染试剂。在培养基置换时，可在病毒收获培养基中加入核酸酶，如Benzonase或 Denarase，或在下游工艺期间添加，以去除残留的质粒以及可能由裂解的细胞所释放的宿主细胞DNA。也可以加入丁酸钠，以提高病毒滴度。从转染后48小时开始，可在不同的时间点收集病毒收获原液，根据细胞为贴壁形式还是生长于基于灌流的生物反应器，最长可收获至96小时。
病毒载体可以使用稳定载体生产细胞系生产，其可组成性生产载体。但是，制备载体生产稳定细胞系是一个非常耗时的过程，也极具挑战性。而获得一个稳定生产细胞系的优势在于，一旦获得，可以更简单地放大至生产规模，其可重复性和安全性也更高，即具有更高的经济效益。
制备稳定γ-生产细胞系相对更为简单，因其具有更简单的基因组。仅需要三个蛋白质编码基因：Gag/Pol、Env以及目的转基因。此外，没有与囊膜蛋白相关的毒性。相反，慢病毒载体更难制备稳定生产细胞系，因其具有更大、更复杂的基因组，以及VSV-G的毒性作用，后者是慢病毒载体最常使用的囊膜。
制备载体生产细胞系时，表达辅助基因gag/pol和env的载体包装细胞系以转移载体转染。除LTR、Ψ包装信号、PPT和GOI外，转移载体还含有抗生素耐受标记，以便通过抗生素耐受基因筛选表达GOI的稳定载体生产细胞系。对于γ-逆转录病毒系统，有还有不同囊膜的不同载体包装细胞系可用，这使得制备稳定的γ-逆转录病毒载体生产细胞系更加容易，有利于大规模生产各种假型病毒载体，以满足临床和商业需求。
对于慢病毒载体，由于VSV-G和Rev对细胞有毒性，组成型慢病毒载体产生细胞系更难制备。有研究制备了诱导性稳定慢病毒载体包装细胞系，如293SFPacLV，其中，VSV-G和Rev的表达由诱导性启动子系统控制。
对于以稳定载体生产细胞系进行的病毒载体生产，细胞复苏并扩增。然后细胞以最佳的密度进行接种，以在病毒收获时，细胞处于对数生长阶段，从而生产高水平的病毒载体。
下游工艺
上游工艺生产获得的病毒收获上清液需经过下游工艺处理，以提高治疗应用的效力和质量。γ-逆转录病毒和慢病毒载体不稳定，可能会在应激条件下失活。所以，下游工艺中的单元操作的数量和设计必须仔细计划，以使收率和产量最大化。
下游工艺的主要步骤包括澄清、浓缩、纯化和制剂，如流程图所示。根据应用和病毒载体的类型，下游工艺包括下图所示的所有步骤或多个步骤的组合。
澄清步骤去除细胞和细胞碎片。以切向流过滤（TFF）方式进行的浓缩和洗滤可去除盐、血清和小分子量的污染物。洗滤也可以将病毒载体置换至最终的缓冲液。层析纯化可去除大部分的杂质。
对小规模生产的病毒载体，澄清步骤可使用离心或过滤方式进行，浓缩可使用超速离心（UC）或PEG沉淀进行。对于UC和PEG沉淀，以感染性病毒单位计算的回收率%一般较高。但是，离心或UC不易规模放大。此外，UC和PEG沉淀所能达到的杂质去除水平不符合针对临床应用的法规标准。
对于用于临床应用的更大规模病毒载体生产，下游工艺会因病毒载体的类型、病毒载体的囊膜以及应用而有所不同。澄清可使用具有合适尺寸的过滤器过滤完成。通常，需要使用孔径不断降低的过滤器链，以防止过滤器堵塞，并最大限度地提高收率。对于GRVV和LVV，浓缩通常使用MWCO 500kD或750kD的中空纤维组件或平板膜包进行，该过程中，低于MWCO的杂质扩散通过膜，进入滤液。在大多数情况中，特别是用于体内应用的病毒载体，在下游工艺中需要使用层析进行进一步的纯化（离子交换、体积排阻或亲和）。如有需要，也可以增加一个终端的小孔径过滤步骤，以确保无菌性，并去除任意颗粒性物质。制剂是下游工艺的最后一步，其对载体的稳定性来说，至关重要。
下游工艺中的每个步骤都需要关注产量和质量，其可通过检测病毒滴度和杂质进行，后者包括宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白质、BSA、内毒素和支原体。除了滴度和杂质外，最终的载体产品也需要通过检测无菌性、外源性物质以及复制完整的逆转录病毒或慢病毒（RCR/RCL）评估其安全性。最终载体产品的质量可通过针对安全性、纯度和效力而设计的分析测试方法进行确定。
下游优化需要仔细地评估每一个步骤，以降低损失，提高载体的质量、纯度和效力。
工艺优化考量
为获得最佳的病毒载体产量，在工艺开发研究中应考虑以下内容。
相比使用稳定生产细胞系进行的载体生产，瞬时系统需要更多的上游优化。对于临床应用，避免使用FBS是一个重要的工艺优化考量，因为其存在病原体污染以及FBS批次间差异性的风险，后者可能会影响终产品质量的可再现性。
上游优化步骤需评估：
关键起始物料 – 细胞库、FBS、质粒（对于瞬时系统）
化学限定培养基，以避免使用FBS
质粒比例（对于瞬时系统）
转染试剂（对于瞬时系统）
质粒 vs 转染试剂比例（对于瞬时系统）
用于细胞扩增的细胞种子扩增链
细胞接种密度
不同培养基配方中细胞生长的特性
DNA与细胞的比例（对于瞬时系统）
病毒收获的次数和时间（对于稳定系统）
为最大限度提高收率，下游优化步骤需评估：
过滤器链
过滤器膜材质
过滤器的表面积（选择最佳的病毒上清液体积与过滤器表面积的比例，以降低损失）
过滤器膜孔径
以LMH表示的过滤流速（L/m2/h）
中空纤维或平板膜包
截留分子量
缓冲液和缓冲液的pH
TFF参数（流速、剪切和跨膜压TMP）
填料
缓冲液，pH
流速
洗脱条件
过滤器膜的材质
过滤器的尺寸和孔径
以LMH表示的过滤流速（L/m2/h）
总结
以载体生产细胞系制造的病毒载体有利于提高一致性、生产的简单性、可放大性以及纯度。已经有多种表达gag/pol和囊膜蛋白的载体包装细胞系可用于γ-逆转录病毒载体。从以往的经验来看，慢病毒载体生产细胞系的生产更具挑战性，因为需要更复杂的基因组和VSVG囊膜（弹状病毒水泡性口炎病毒）以假型大部分慢病毒载体。已知Rev和VSVG对细胞有毒性，所以很难整合进细胞系，以制备组成型包装细胞系。慢病毒载体包装细胞系可通过修饰其它更低毒性的囊膜来制备，后者通常用于γ-逆转录病毒。例如，修饰的4070A（两性小鼠白血病病毒）、GALV（长臂猿白血病病毒）以及RD114（猫内源性逆转录病毒）已经被用于慢病毒载体的瞬时生产，且获得的积极的结果。Broussau等制备了一种诱导性慢病毒包装细胞系，293SF-PacLV，其中，Rev和VSV-G的表达受到Tet和Cumate双开关系统的严格调控。这种细胞系可在无血清培养基中悬浮生长，使其成为针对临床和商业化应用的规模放大和大规模生产的理想选择。最近，Manceur等使用这种293SF-PacLV包装细胞系，通过GFP质粒转染细胞系，获得了表达GFP的诱导性慢病毒稳定生产细胞系。这种稳定GFP慢病毒生产细胞系被称为Clone 92，可生产高滴度的病毒。通过优化上游工艺步骤，如细胞密度和培养基置换，GFP病毒载体的产品可进一步增加。
目前，大多数慢病毒载体生产都是瞬时的。对于临床应用，使用瞬时系统存在几个缺点，主要是批次间的差异性、产品成本（CoG）以及由于使用质粒和FBS而导致的潜在污染风险。此外，瞬时转染中的病毒载体选择窗口更小。从瞬时向稳定慢病毒载体生产系统细胞系的转变将是向前发展的一大步，因其可提高上游工艺的可重复性，同时，也可降低产品成本（主要是质粒和FBS成本），继而降低供应链的风险。此外，从针对临床应用的靶细胞选择来说，慢病毒载体有更广泛的应用，因其可稳定转导非分裂细胞，且相比γ-逆转录病毒，其遗传毒性更低。使用Broussau等以及Manceur等介绍的可诱导双开关系统，或类似的方法，稳定慢病毒生产细胞系的制造将更加可行，且可用于生产用于临床前和临床应用的病毒载体。其它的优势包括可以在使用无血清培养基的悬浮细胞培养体系中进行稳定细胞系的生长和规模放大，这一点进一步增加了其吸引力，可能是优化病毒载体生产的下一代发展趋势。已经有多家公司可以为制备慢病毒载体稳定生产细胞系提供定制化服务，包括Patheon、Oxgene和CEVEC。Oxford Biomedica可提供高产量慢病毒生产细胞系。在基因和细胞治疗中，使用逆转录病毒载体作为基因递送载体的下一步发展，将是提高稳定病毒载体生产平台的适应性，以获得可在无血清培养基中生长的慢病毒载体稳定悬浮生产细胞系。
原文：R.Sengupta, Gammaretroviral and lentiviral vector manufacture: brief overview. Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(3), 345–354.
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