CHO细胞的灌流培养：系统配置
本文节选自“Perfusion culture of Chinese Hamster Ovary cells for bioprocessing applications”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“针对生物工艺应用的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的灌流培养”。
系统配置
历史上，灌流生物反应器的配置有很多独特的方式。然而，随着时间的推移，配置的多样性已经集中在更小的实用设置选择上。这些物理因素影响着灌流反应器如何在商业化过程中的利用和规模化，并且是行业对这种操作方法的持续兴趣的主要驱动因素。
生物反应器罐
传统的进料分批生产方式几乎完全采用大规模 (2,000-20,000 L)搅拌槽罐生物反应器(STR)。在文献中能见到的基于灌流的操作中，生物反应器的设计更加多样化，可以分为：STR、摇摆式生物反应器，或基于特定“基质”的生物反应器。
由于STR的简单性、通用性和可放大性，在科研和工业中最广泛使用的生物反应器装置就是STR。在灌流操作中，STR可以使用一系列的不同截留装置，操作范围从mL级到2,000L或者更高，作为种子或生产生物反应器，以及用于培养悬浮细胞或基于微载体的贴壁细胞系。在检索的文献中，超过75%的文章使用了STR。自2015年以来，随着悬浮培养和大规模操作的日益普及，STR在文献中所占比例已超过90%。重要的是，一次性使用STR已经得到了充分的开发，且已有成熟的商业化产品。
摇摆生物反应器用于悬浮培养主要是在1998年发明WAVE生物反应器后出现的。这些反应器的混合模式可降低剪切，并消除了对内置搅拌和鼓泡的需要。然而，由于它们的动力学模式，它们的体积很少超过200L。尽管交替切向流(ATF)和切向流过滤(TFF)允许细胞密度接近200x 10^6 cells/mL，但摇摆生物反应器的持续运动模式使其易于使用简单的静态膜过滤器。自2011年在CHO相关文献中出现以来，摇摆生物反应器已在大约10%的灌流培养文献中出现。而现在摇摆生物反应器更多用于商业化生物工艺的种子扩增。
这里将基质生物反应器定义为使用固定基质(如填充床或膜)来捕获或锚点培养物，并通过培养基流动实现混合的产品。这类产品在新设置中有很大的差异，部分由于它们的广泛定义。在这些类型中，最常见也最早的是填充床，占7%，特别是Meuwly等人在21世纪初的研究。利用深层过滤器作为培养基质的系统也在此10年后被进行了探索。虽然基质生物反应器具有固有截留能力、低剪切应力和适合贴壁细胞系的优点，但它们在取样、混合和规模放大方面面临不小的困难，这严重限制了其商业适用性。虽然一些新的设计最近得到了应用，但在基于CHO的生物工艺中，基质式生物反应器在很大程度上已经过时了，但它正在越来越多地应用于其它应用，如细胞治疗。
总而言之，由于STR具有悠久的历史、广泛的应用、简单性和通用性，它很可能会继续主导灌流研究。摇摆生物反应器可能继续作为STR的补充，特别是在种子扩增中。摇摆生物反应器和STR都拥有大量的商业化平台，这些平台将促进进一步的使用。
截留方法
细胞截留是灌流生物反应器的决定性特征，是实现其伪稳态运行和高细胞密度优势的关键。截留方法通常可根据从培养基中分离细胞所依据的特性进行分类，大小和密度几乎是最常被利用的特性，由于其简单、可放大性以及保持细胞活性和产品质量的相关性。通过废弃（bleeding）离开反应器的培养液不通过截留装置，因此，其中含有的细胞，要么被丢弃，要么需要在单独的工艺中进行澄清。
专用的截留设备通常包括基于膜的(MB)过滤器，它可以分为静态、动态或切向流(TF)。无膜(非MB)的专用截留装置分为离心、水力旋流、声学或重力沉降等主要类别。新型过滤设备，如基于微流控的过滤设备，虽然已经开发出来，但应用相对较少。这里的“固有截留”是指不使用专用截留装置的基于特定基质的生物反应器的截留方法。
膜过滤器是灌流生物反应器中最常用的细胞截留方法，并且随着时间的推移，变得越来越流行。膜过滤器通过多孔膜上施加压差而根据颗粒大小选择性截留细胞。在这些方法中，颗粒与膜的直接加压接触使其容易受到污染，特别是在细胞密度高且时间长时，而这两种特性是灌流培养的主要好处，因此行业已经采取了多种方法来减少污染。例如，静态膜过滤器通常用于摇摆生物反应器中，其中反应器内的动态混合可以被动地清洗过滤器表面。
静态膜过滤器是“被动”的，而动态膜过滤器和切向流则可主动地在培养液和膜之间产生相对运动。在21世纪之初，动态膜过滤器非常普遍，包括自旋转过滤器和旋转碟片式过滤器。与静态膜过滤器相比，动态膜过滤器不容易产生污染，但动态膜过滤器需要移动部件，并需要安装在生物反应器内，这增加了污染风险，使得过滤器的更换难以实现。由于动态膜过滤器不能以一次性使用的形式提供，在延长的培养期间，这些问题带来了很高的失败风险，限制了在商业化生产中的应用。即使将自旋过滤器与其它技术(如超声截留)相结合，可以减少堵塞并增加过滤器的寿命，其使用中的种种复杂性导致了文献中报道的动态膜过滤器的持续下降。
切向流（TF）在2010年代早期作为动态膜过滤器的替代品出现。在同样的原理下，切向流驱动培养液通过静态膜。这种流动通常由外部泵驱动，允许过滤单元安装在生物反应器外部。这支持实现模块化和可放大性，并解决了动态膜过滤器的许多问题，使切向流成为现在最常用的截留方法。在它的子类型中，ATF（交替式切向流）系统在文献中的受欢迎程度是TFF（切向流过滤）的两倍。各研究小组已经进行了一些直接比较研究，发现与其它截留装置 (如动态膜过滤器)相比，ATF可提供更高的单位体积产量。比较两种TF方法，我们发现，相比TFF，ATF可延长过滤器的寿命。尽管很受欢迎，TF也与所有膜过滤器一样，会产生不同程度的产物截留。这个问题已经通过提高膜孔径来解决，但要付出额外的下游过滤步骤的代价。当细胞密度极高时，由于中空纤维膜较难处理相应更高的料液粘度，TF的性能也会降低。随着细胞密度和产量的进一步提高，这一领域也需要更新的策略。
为了绕过污染和其它与膜过滤器相关的问题，人们还探索了非膜的截留方法。当然，这些方法对污垢和产物截留“免疫”，但也有其它的缺点。声学过滤器曾经是最常见的非膜方法，但由于其有限的可放大性，在高细胞密度下的性能下降，以及与一次性使用系统的不兼容性，自2014年以来一直没有在文献中看到。离心机的分离效率非常高效，但施加的力也很大，会破坏细胞，产生聚体，还可能需要专门的生物反应器设计。水力旋流可以与一次性使用系统兼容，并选择性截留活细胞，但它们的不完全截留会造成持续的废弃。重力沉降是一个非常温和的过程，剪切力低，同时也相对简单且稳健。然而，重力沉降需要在截留装置中停留很长时间，那里的培养条件并不理想，而且很大程度上不受控制。另一种方法是使用絮凝剂，将絮凝剂添加到生物反应器中，通过使细胞聚集在一起来增加颗粒大小。这可以提高培养过程中的过滤，或可用于在收获期间沉淀和提取生物质。然而，絮凝剂可能会干扰下游纯化，它们需要额外的清除考虑。
随着近年来被广泛采用，切向流系统很可能会继续在灌流领域占据主导地位，无论是在学术上还是在商业上。结合STR和一次性技术的广泛采用，近年来灌流配置逐渐向STR和TF截留相结合的方向发展，这可能会带来额外的优势，增加常见产品和服务的可用性。这种平台设置的建立可能会在未来几年促进灌流研究的广泛采用和进步。
收获方法
灌流生产的一个主要优势是能够连续收获产物。因此，在工业4.0背景中，灌流是实现完全集成的连续生物工艺的合理步骤。然而，大多数下游装置仍然是不连续的工艺，这些单元很难过渡到完全连续的运行。因此，收获液的处理方式会影响生物反应器的规模和截留装置的选择。例如，膜过滤器截留装置可以通过采用小于产物直径的超滤孔径，选择性地将产品截留在生物反应器中，允许批次收获。相反，大于产物直径的孔径规格将同时滤过可溶性产物与废培养基，允许连续纯化。由于切向流过滤器在生物反应器罐的外部运行，它们也可能允许更换不同孔径的过滤器，并允许半批次式操作。然而，由于部分污染和/或产物与膜材质的相互作用，无论其孔径大小，膜过滤器截留装置仍然会产生产物截留。因此，对于需要关注产物截留的工艺，如不稳定产品，或需要连续纯化的工艺，选择截留技术时需要仔细的权衡和评估。
规模缩小模型
随着灌流培养的普及，工艺条件的优化以及针对新的需求选择合适的培养基或细胞系，是必要的。可以预期，这种多维分析需要进行许多尝试，增加了与开发相关的成本和风险。这对灌流来说是一个特别的挑战，因为极端的细胞密度和其操作的连续性使得灌流运行非常困难。因此，合适的模型系统的可用性变得至关重要，自2015年以来，已经进行了不少相关的研究。在这些模型中，最广泛使用的小规模模拟灌流工艺的方法是在50mL摇管中进行培养(如TubeSpin)。培养液易于离心，以进行不连续的培养基置换，被称为半灌流。在这种缩小的规模条件下，保持所有变量(如流体动力学)之间的一致比例在技术上是困难的，可能会影响小规模工艺开发到生产规模的直接转换。尽管存在这些困难，Tubespin方法已成功用于估计最低细胞特异性灌流速率(CSPR)、培养基开发、产品质量和生产力。通过对不同运行模式和规模的比较，这种相对经济高效且高吞吐量的系统显示出了很有前景的优点。
然而，使用摇管在溶氧(DO)、pH、搅拌速度等参数的控制和优化方面有明显的局限性。在这方面，可以使用超小规模的STR，如自动化的AMBR-15系统，其可更容易地集成到实验设计(DoE)工作流中。这一技术已实现了超过70 x10^6 cells/mL的细胞密度以及可转移到1000 L生产培养的产物质量属性。该系统通常采用重力沉降作为截留，通过开发定制的离心机，可以缩短沉降时间少，细胞密度可达到95x 10^6 cells/mL以上。该方法还被用于估算不同细胞系的CSPR和培养基需求。最近推出的AMBR-250灌流系统也保证了更接近工艺规模的模拟，但自然，这需要更高的购买和操作成本。因此，50mL试管和AMBR-15方法有可能继续作为灌流培养的初始优化和筛选的规模缩小模型。
灌流类型
虽然在传统意义上运行灌流反应器意味着要在假稳态条件下运行，但已经报道了许多不同的方法，利用改良的灌流来进行生产。特别是，与进料分批操作相结合提供了许多选项。以N-1灌流和随后的补料分批生产生物反应器的形式分离生长和生产阶段的尝试相对常见，并得到了充分的讨论。当在混合灌流/补料分批式生物反应器中结合两种操作模式或类似的初始高稀释及随后低稀释率时，由于细胞密度高而获得了相同的成功。通过N-1灌流和生产连续搅拌罐反应器(CSTR)之间的连续连接，进一步探索了这一想法的延伸，在提供连续产品液流的同时，提高了生产率。此外，前面提到的选择孔径小于产品尺寸的膜装置，允许开发强化的补料分批工艺，其中产物截留在反应器内直到运行结束，同时系统受益于连续的培养基置换。
总的来说，这些系统是统一的，它们试图利用灌流工艺中能够获得的高细胞密度，同时最大限度地减少其缺点。为了找到最优的操作模式，可能需要进行差异化的经济和产品评估。
原文：M. A. MacDonald, M. Nöbel, D. R. Recinos, et al., Perfusion culture of Chinese Hamster Ovary cells for bioprocessing applications. Critical Reviews in Biotechnology, 2021, https://doi.org/10.1080/07388551.2021.1998821.
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