细胞收获步骤：分离“好的”和“坏的”
本文节选自《Cell Harvesting Steps Separate the Good from the Bad》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。文中观点仅代表原作者和受访人。
必须在去除碎片和杂质与最大限度地提高产品质量和收率之间取得平衡。
上游和下游的生物工艺操作通过细胞收获步骤联系起来。细胞收获是一个关键的单元操作，旨在去除细胞、细胞碎片以及其它可溶性和不溶性杂质，这些成分有害于随后的层析分离步骤。
选择正确的收获技术至关重要；此步骤的结果将影响所有后续的纯化操作。所选择的技术必须匹配上游细胞培养工艺的特点(贴壁或悬浮、高或低滴度等)以及产物的性质(蛋白质、病毒、细胞等)，同时提供适合后续所需纯化步骤的生物工艺料液。最合适的收获技术也需要适应细胞培养过程中不可避免的批次间差异。
不断提高的细胞密度和工艺体积
成功进行收获的最大挑战可以归因于不断提高的细胞培养工艺的产量。MilliporeSigma生物工艺部门负责人Darren Verlenden说:“近年来，上游工艺的显著进步导致传统方法在澄清问题上出现了瓶颈。”
例如，根据Sartorius分离应用专家Susan Prochazka的说法，随着细胞培养工艺的强化，细胞密度和产物浓度也在增加。因此，需要更大的过滤面积和生产工厂占地。
一个例子是处理 >20 x 10^6 cells/mL的细胞密度，这在高滴度工艺中很常见。Verlenden解释说:“高细胞密度的工艺往往伴随着更多的杂质，包括DNA、宿主细胞蛋白和细胞碎片，这可能会对下游工艺造成严重的破坏。”他补充说，最佳的收获澄清有助于去除这些杂质，以缓解高密度进样料液对更下游的步骤的挑战。
在某些情况下，例如对于病毒载体和其它病毒生产工艺，选择正确的时间收获可以提高产品回收率，同时最大限度地减少细胞碎片。Prochazka补充说，对于其它需要通过细胞裂解来分离细胞内产物的方法，会产生大量的细胞碎片，以及不同大小的碎片，这些碎片可能会挑战深层过滤器以及可能的除菌过滤器。
因此，Avid Bioservices工艺开发副总裁Magnus Schroeder表示，有能力根据可检测的进样料液特性预测最佳的收获过滤系统非常重要。“总的目标是最大限度地减少产品损失和细胞损伤，同时最大限度地去除杂质。实现这一目标的最佳方法是确定高处理量、高吞吐量的收获解决方案，这些解决方案使用实验室规模生成的数据，具有高度可放大性和稳健性，能够应对进样料液属性的相关变化。”
悬浮 vs. 贴壁细胞培养
虽然悬浮细胞培养通常是首选的，大多数新的生物工艺使用这种方法，但仍然有许多工艺基于贴壁细胞培养，要么因为它们最初就是这样开发的，要么因为由于细胞的性质。小规模贴壁细胞培养工艺传统上采用滚瓶或细胞培养瓶等形式进行，但规模放大不佳。更大的贴壁细胞培养工艺采用微载体，在现有的上游悬浮平台或固定床生物反应器中为细胞提供贴壁支持。
Prochazka说，对于细胞收获，在大多数情况下，贴壁式细胞培养工艺面临的挑战较少，因为上清液含有较少的细胞碎片，通常可以直接通过生物负荷降低级过滤器或除菌级过滤器进行过滤。不过，她也注意到，这些工艺中有许多涉及病毒或病毒载体，由于它们带电的性质，往往更容易粘附到深层过滤器上。
对于依赖微载体的工艺，细胞通常需通过暴露于酶 (如胰蛋白酶) 的一个短孵育期而释放出来的。Orgenesis执行副总裁Peter Molloy表示，需要专业知识来找到合适的胰蛋白酶浓度和孵育时间，以避免过度暴露而损伤或杀死细胞。他指出:“我们正在通过开发新的生物可降解微载体来克服这些挑战。”
Verlenden说，然后可以使用大处理量梯度过滤器以及合适的二级精纯深层过滤器在下游去除游离的微载体。同时，对于在固定床反应器中进行的贴壁工艺，澄清可能集中在使用中间级和精纯深层过滤器进行的细胞碎片和杂质去除。
Molloy说，尽管悬浮细胞培养工艺更具可放大性，但细胞收获也具有挑战性，因为找到合适的技术需基于待收获的细胞的密度和类型。他指出，常见的方法包括离心、微滤、深层过滤和膜过滤，或这些技术的连续组合。
Verlenden补充道，通常情况下，用于悬浮细胞培养工艺的细胞收获将涉及由初级和二级步骤组成的两阶段澄清程序，或可进一步提高澄清性能的预处理技术。Prochazka观察到，对于这些工艺来说，增加细胞和产品密度会导致过滤面积增加，从而增加工艺成本和占地面积。
细胞即为产品
当细胞本身就是产品时，细胞收获是相当具有挑战性的。不像在细胞培养结束时去除细胞的传统细胞培养工艺，在细胞治疗中，目标是尽可能地收获细胞。Molloy说:“细胞是脆弱的，并且对剪切非常敏感。”因此，重要的是要考虑到细胞的密度和活力，并确保在收获过程中造成的破坏最小化。他补充说，此外，还必须防止裂解，以避免潜在的细胞死亡。
Prochazka说，考虑到细胞的敏感性是主要的挑战，应该使用具有极低剪切力和高产品回收率的技术来收获细胞。她指出，Sartorius提供的一种一次性连续离心系统，可以将细胞保持在流化床中，与传统离心机相比，在流化床中细胞可以被浓缩或培养基可以以一种非侵入式的方式置换。她说：“这种方法是有益的，因为它可以在无菌条件下操作，这一点很重要，因为细胞体积很大，无法进行除菌过滤。”
Verlenden表示，声波技术是另一种可放大、降低成本、提高质量的有效解决方案。MilliporeSigma开发了一种基于这种技术的解决方案，他说，该方案提供了一种更温和、高效、封闭且自动化的系统，可以替代目前用于细胞收获的机械和过滤方法。
需要独特的方法
细胞培养澄清本质上是去除碎片和杂质、同时确保高产品质量和产量之间的一个微妙的平衡。Verlenden说，因为每一个工艺和产品都有独特的特点，每一种产品模式和细胞系都需要独特的细胞收获和澄清方法。
“多年来，该行业在处理单克隆抗体(mAb)工艺方面获得了重要的专业知识；然而，随着新的药物模式不断获得市场份额，随着非中国仓鼠卵巢（CHO）表达系统 (植物细胞、微生物、昆虫)的采用，可能需要对新的澄清方法进行调查和评估，包括在生物反应器中添加絮凝剂对进样流进行预处理，”Verlenden说。
例如，Schroeder指出，对于一些复杂的重组蛋白和低等电点的抗体，产品会结合到深层过滤器基质，因此产量损失，必须仔细考虑。Prochazka重申，吸附对其它带电活性物质也是一个挑战，包括病毒载体和其它基于病毒的产品，以及基于RNA的药物和疫苗底物，因为它们与过滤材料的相互作用水平更高。她补充说，对于这些产品，可能还需要一个封闭的无菌澄清步骤，以确保操作人员安全性和产品的无菌性。当使用一次性系统时，耗材质量和相容性问题也必须得到解决。
Prochazka说，与此同时，向强化生产的转变产生了对连续收获技术的需求。
创新的解决方案解决了许多挑战
在保持或提高产品产量的同时，从更高细胞密度培养液中收获产品的需求，促使企业转向培养液澄清的创新解决方案，包括一次性设备、大处理量深层过滤器以及预处理进样料液。
“在澄清深层过滤方面的改进，包括支持更高吞吐量的带有梯度过滤介质的高处理量过滤器、全合成过滤器、优化用于预处理进样料液的深层过滤器，都有益于大规模生产，因为可降低达到与传统初级和二级过滤系统相似的效率所需的过滤器数量，Verlenden认为。
Schroeder认为，除了合成深层过滤基质，混合过滤器形式和额外的预处理步骤 (如絮凝和助滤剂) 可以在提高生产率、吞吐量和额外的杂质去除方面提供价值。他说：“虽然主要通过增加细胞质来提高细胞培养效率的方式可能会带来深层过滤能力方面的挑战，但絮凝剂和助滤剂等替代方式可以通过提高过滤能力来帮助克服这些限制。”
Sartorius专注于开发一次性使用的无菌歧管，其可以连续处理来自大规模、高细胞密度单抗工艺和细胞治疗的物料，工作体积从0.5L到50 L不等，均具有高回收率。
Prochazka指出，将纤维素深层过滤从囊式转换为盒式，尽管增加了批次体量，但易于放大和构建，且占地面积小。然而，当深层过滤不适用于澄清高密度培养细胞时，Sartorius正专注于使用带有一次性无菌歧管的离心机。根据Prochazka的说法，这些系统可以连续处理高达2,000 L的高细胞密度单抗工艺和工作体积低至500 mL的细胞治疗工艺中的物料，在使用低剪切力的情况下，获得高回收率。
更多的进步即将到来
目前用于细胞收获的一些新技术有望在不久的将来从进一步的发展中受益。Schroeder表示，深层过滤技术的改进将通过添加定制的功能基团来实现固体/胶体去除能力以及杂质去除能力的结合，降低下游纯化步骤的负担，并可能减少达到终产品质量标准所需的总纯化步骤的数量。
Verlenden期望改进用于细胞和细胞碎片絮凝的前处理方案。他指出，这项技术将实现更小的颗粒聚集，因为这些颗粒难以离心，可能堵塞传统的下游过滤器。“预处理产品，包括阳离子絮凝聚合物和带有梯度密度结构的带电深层过滤器，是专门设计来处理颗粒大小分布的，并通过减少宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA等可溶工艺杂质，来提高澄清步骤的一致性和效率，”他说。
Prochazka说，一些更老的、用于细胞收获的替代技术也可被重新使用。她指出，结合沉淀法或絮凝法的沉降技术有望用于非常高的生物量上样。
与Prochazka一样，Verlenden也希望在商业规模上继续采用一次性技术，以满足生产效率以及封闭、强化和连续工艺的需求。“一次性技术正在被广泛应用于细胞分离和下游应用，提供的好处包括降低产品交叉污染，降低工艺时间和运营成本，提高生产率，并提高质量，”他断言。
原文：C. Challener,“Cell Harvesting Steps Separate the Good from the Bad," BioPharmInternational, 33 (10) 2020.
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