细胞和基因治疗生产的过程分析技术
本文节选自“Process Analytical Technologies for Manufacturing Cell and Gene Therapies”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
时间就是一切，加速实时监测解决方案的开发将是行业的理想选择。
确定细胞和病毒的质量是成功的细胞和基因治疗生产的核心。可实现生产过程实时监测和反馈控制的过程分析技术(PAT)具有提高生产力和产品质量的潜力。一些解决方案目前已经可用，并已被行业采用，但它们确实仍存在一定的局限性。
在将PAT广泛应用于细胞和基因治疗生产之前，需要对工艺和产品有更深入的了解，并在基础技术方面取得进展。然而，围绕这些新药物的兴奋感很可能有助于推动所需的创新。
实时监测和反馈控制的众多好处
龙沙细胞疗法研发副总监Inbar Friedrich Ben-Nun表示，细胞和基因疗法生产的实时监测和反馈控制将允许实时决策，减少工艺瓶颈，并增强工艺的可重复性和批次间的可比性。细胞和基因治疗弹射器（Cell and Gene Therapy Catapult，CGTC）合作经理Richard Harrison补充说，在仍然可以做出未来生产决策的时候，提供时间敏感的信息可以增加工艺数据的价值。
Friedrich Ben-Nun表示，人工干预的减少也有助于批次差异性和/或故障的减少，并通过减少用于分析的各种离线设备的使用以及人工，降低生产成本。Harrison观察说，成本的降低还可以通过将工艺强化为更小的占地面积以及减少运行工艺所需的操作员的数量来实现，而故障发生时的早期警报将有助于最大限度地减少产品损失，并将资源分配给失败的批次。
诺华细胞治疗全球技术开发主管Pratik Jaluria表示，除了开发和实施稳健且一致的生产流程外，实时监测和反馈控制还能使生产方式更加灵活、可调，而不是“一刀切”策略。CGTC技术和工艺创新资深科学家John Churchwell评论说，这对于获得更高的产量以及应对自体疗法供体之间的差异性将特别有益。
Jaluria说，通过实时监测和反馈控制，还可以对可预测临床疗效和安全性的关键输入/输出进行更深入的了解。AGC Biologics细胞与基因治疗米兰卓越中心的分析方法开发经理Francesca Rossetti表示，与此同时，分析时间的缩短将缩短整个产品放行时间线。“产品的实时放行，”Churchwell总结道，“将节省时间和金钱，更快地为患者提供治疗。”
鉴别正确的参数
在先进治疗药品(ATMP)生产中应用质量源于设计(QbD)方法和PAT进行实时监测和反馈控制，首先需要鉴别相关的关键工艺参数(CPP)，这可能具有不小的挑战性。“虽然许多关键质量属性(CQA)是直观的，例如细胞疗法的质量、纯度和效力，以及病毒载体的滴度、感染性和空/完整衣壳比，但与这些属性相关的过程参数并不明显，”Churchwell解释说。
“一种有效的方法是利用生物标志物鉴别策略，包括应用生物信息学和系统生物学工具，如通路分析和典型相关性分析，来研究这种相关性，”Churchwell认为。
针对细胞治疗的上游控制
细胞数量和质量是细胞治疗应用有效性和患者安全的关键。然而，据Nirrin Technologies创始人兼首席技术官Brian Hassell称，目前的细胞疗法生产工艺相对分散。“因此，未来PAT解决方案的目标将是连接细胞治疗过程的所有部分，”他说。
Friedrich Ben-Nun说，上游细胞治疗工艺通常是连续的，涉及到允许细胞激活、细胞扩增和细胞成熟或分化的长培养期。细胞密度可以影响培养过程的许多方面，从气体交换到培养基更换的频率。与此同时，这一过程中的变化会影响细胞的活性和性能。
Friedrich Ben-Nun评论说:“由于这些原因，在上游工艺中监测细胞密度、细胞活性、培养基中的营养/代谢产物、培养基中的生长因子、细胞性能 (即细胞因子分泌)、细胞特性 (通过细胞表面标志物或遗传标志物) 以及生物负荷将是理想的。”
然而，细胞疗法的下游工艺通常与传统生物药不同。Jaluria解释说，细胞通常不通过传统的层析柱进行纯化，虽然磁性柱可以通过将可溶性成分先加入到细胞而使用。
“考虑到细胞疗法下游工艺的时间较短，应用PAT解决方案可能是多余的或过多的，特别是如果它们还没有被监管当局采纳作为传统基于细胞的检测方法的替代品。然而，这种情况会导致具有风险的工艺，直到所需的参数可以被测量，”Friedrich Ben-Nun说。
Jaluria补充说，由于细胞疗法的下游工艺实际上更多的是关于细胞洗涤和缓冲液置换，配备了能够实时监测特定质量属性的传感器的灌装技术将非常受欢迎。
理想情况下，Jaluria观察到，每个单元操作对细胞回收的影响，包括所需的种群、细胞代谢状态和其它细胞特性将被评估。“一般”，Hassell总结道，“我们需要能够在观察细胞身份、数量和质量/功能的定量读数的同时，调节转导和扩增培养参数，并在下游具有类似的能力，以确保在给患者给药前，最终的纯化、制剂和储存不影响任何上述属性。”
病毒疗法需要更多的病毒相关监测
虽然对于病毒载体，宿主细胞不是治疗产品，但许多相同的工艺参数需要在上游工艺过程中进行监测 (例如，细胞转染或感染)。Friedrich Ben-Nun说，应当监测的其它上游CQA包括病毒颗粒的生产和包装(完整/部分/空衣壳)。Rossetti同意实时监测在病毒颗粒测试中也将是有用的，以确定载体收获的最佳时间。
Friedrich Ben-Nun说，在下游工艺过程中，需要连续监测过程，确认病毒产品浓度，检测生物负荷，确定空vs. 完整衣壳，并检测聚体和其它工艺相关杂质。“颗粒聚集，”Rossetti强调，“是一个非常重要的参数，应该实时监测，以降低过滤收率过低的风险。”
总的来说，Jaluria认为PAT可以帮助降低当前病毒载体生产过程中常见的批次间差异，这可以影响一系列的输出，包括产量以及与放行检测相关的各种特性。Friedrich Ben-Nun证实:“在生产的所有阶段实施PAT可以提高工艺效率，提高产品质量和安全性。”
PAT在细胞和基因治疗生产中的初步应用
目前，只有少数PAT解决方案被用于细胞和基因治疗生产。其中许多与用于传统生物药细胞培养工艺的技术相同，包括用于监测溶氧、pH值、温度和其它基本过程参数的传感器。但是，大多数CQA的分析仍然是离线执行的，这限制了它们增强过程控制的价值，Hassell说。
针对葡萄糖/pH值的酶贴片传感器和基于基本电容的pH探针可能是目前应用最广泛的PAT解决方案，Harrison观察到。对于更复杂的分析监测，他指出拉曼光谱代表了最成熟的复杂光谱PAT工具。不过，总的来说，Churchwell认为在该领域，先进PAT在上游ATMP生产中的应用有限，PAT在细胞和基因治疗生产中的应用还处于起步阶段。
然而，先进PAT技术，如拉曼和2D荧光光谱，的应用已经被证明，能够实时监测大量的额外参数，Churchwell说。例如葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、氨、总细胞密度和活细胞密度(TCD/VCD)、产品滴度、辅助因子、维生素和氨基酸。他说，电容/介电光谱法还可以直接监测活性生物质。
特别是对于一些病毒载体，Jaluria补充道，过程中尺寸分析(即细胞大小变化)和可视化通常用于上游监测，同时，评估颗粒形成的技术(电荷检测质谱、低温电子显微镜、反相高效液相色谱法在中间体中的应用越来越广泛。
在下游纯化过程中，Friedrich Ben-Nun指出，在深层过滤过程中，在线压力检测作为一种PAT解决方案，可用于指示细胞疗法和病毒载体的堵塞情况。她还指出，在用于收获和制剂步骤的切向流过滤过程中通常会进行在线压力和电导率监测，而在病毒载体的柱层析中，会执行在线压力、pH值、电导率和UV吸收监测。
Churchwell指出，多角度光散射(MALS)可以测定腺相关病毒(AAV)载体的分子量，并在下游纯化中定量空/完整衣壳比。
当前的限制
PAT尚未广泛应用于细胞和基因治疗生产的原因有很多。在基本层面上，由于需要相对先进的分析技术，获得适当技术的机会仍然有限。根据Jaluria的说法，还需要PAT方面的专业知识，因为在许多情况下，在PAT可以实施之前，现有的工艺/工作流需要进行重大修改。
“最广泛的过程中测量只提供非常基本的过程信息。虽然更复杂的光谱PAT解决方案，如拉曼和其它光谱技术，可以提供越来越丰富的数据包，但它们很难在一个过程中稳定地实施，需要专门的专业知识和实验发现运行，以达到所需的性能水平，”Churchwell解释道。“所有先进PAT都有优点和缺点；在灵敏性和化学特异性之间经常存在取舍，”他补充道。
Hassell强调，稳健性也是必不可少的，因为每个公司的工艺都是不同的。然而，PAT传感器要达到足够的动态范围仍是一个难以置信的难题，这主要是因为工艺可能会有2到3个数量级的差异，而对样品的操作(浓缩、稀释)会带来误差。他坚持认为:“为了实现有效的PAT，传感器需要能够适应动态范围，并在所有场景中工作。”
根据Friedrich Ben-Nun的说法，细胞和基因治疗生产过程的复杂性也是一个重要因素。测量培养基中的关键因素，如小分子和生长因子，使用目前的PAT解决方案通常是不可能的。她说，这些工艺中使用的原材料的复杂性也会阻碍目前PAT技术的采用。此外，对产品的高水平理解需要多次实验，任何工艺更改都需要重复这项工作。结果，至少在最初，可能导致生产延迟和/或偏差，这会使工艺和产品处于风险之中。
更多的产品理解、更好的取样、以及挑战
根据Friedrich Ben-Nun的说法，需要通过运行许多实验来实现产品CQA与CPP的连接，从而获得更好的产品和工艺理解，这是在细胞和基因治疗生产中实施PAT所面临的一个重要挑战。另一个是在一些生产过程中涉及到大量的单元操作，这意味着必须测量大量的CPP，以及需要与PAT实施相关的更高的资本投资。
此外，虽然监管机构正在鼓励在传统生物工艺中使用PAT，并可能接受甚至鼓励PAT用于细胞和基因治疗的生产，Friedrich Ben-Nun观察到，目前尚不清楚PAT解决方案是否可以取代目前的离线生物分析，例如，细胞性能和生物负荷水平。
同时也存在一些基本的技术挑战。“许多可用的工具并没有明确地被设计用于细胞和基因治疗应用，在使用前可能需要重新设计或进行质量确认，”Churchwell解释道。他补充说:“因此，在未来几年，我们可能会看到许多为这个市场量身定制的新设备出现，这些设备将允许连接相关的先进PAT解决方案。”
对于细胞疗法，Jaluria指出，需要快速获得有意义的细胞特性测量，并且在样品制备和操作过程中物料不会发生变化，这样的结果才能代表将继续后续处理的原液。他说：“能够实时提供放行属性的可靠在线传感器还有待开发。”
Jaluria说，对于病毒载体来说，围绕这些物料的较小颗粒尺寸存在一些挑战，其中一些只能通过分子方法来量化，如聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验(ELISA)技术。
样品大小也是一个问题。PAT方法必须开发具有高度灵敏性且只要求非常小的体积，因为工艺中间体是珍贵的物料。Hassell认为，仪器的性能需要同时适应小样品和大动态范围。
在这种情况下，仪器还必须能够进行最小限度的校准，并仍能给出准确的测量，特别是当PAT被应用于自体疗法时。Hassell强调说:“所有的患者都是不同的，在工艺和产品方面存在巨大的差异，因此在未知的情况下，稳健性是至关重要的。”需要对不同规模和平台的集成进行标准化，并接受用于开发和实现PAT解决方案的可靠缩小模型。
Churchwell表示，组织对应用于ATMP的QbD方法以及结合PAT以实现数字化生产缺乏认识是另一个巨大的挑战。“行业对自动化、物理技术和数据分析/统计建模方法的理解有限。实施PAT解决方案需要一种综合的方法，包括生物标志物/CQA鉴别、PAT传感器应用以及实验设计方法的应用。”
Rossetti补充说，用于表征ATMP的大多数分析方法非常复杂且耗时，这是开发有效PAT解决方案的一个重大障碍。她解释说:“这些分析中有许多无法以一种实时产生结果的方式进行。” 在AGC Biologics，为了帮助降低这些挑战，公司开发了一个定制的分析平台。对质量控制所需样品的数量和体积的优化允许实现更快的周转时间并减少产品消耗。
全行业的协作努力，以推进解决方案
细胞和基因疗法的跨学科性质需要研究和开发工作的多方面合作，其将横跨物理、化学、细胞生物学、工程、计算机科学和许多其它领域。
Jaluria认为，监管当局和药物开发商围绕细胞和基因治疗生产所面临的众多挑战展开更多对话，也可以为如何评估和实施新技术奠定基础。他说:“这种相互作用的一个潜在结果可能是编写通用指南，由国家或国际机构提供围绕新型分析技术的途径和最佳实践，推动该领域的发展。”
与此同时，与国家生物药创新研究所、BioPhorum Cell & Gene Therapy和CGTC等全行业的协作，使企业能够在先进的解决方案方面获得更多的合作。
其中一个例子是CGTC成立的PAT联盟，其旨在加速技术开发，并有可能降低细胞和基因治疗的生产成本。该联盟将建立行业意识，并利用相关技能集，以实现PAT技术、数字化自动化战略和传感器集成的更快吸收。该联盟由20多个组织组成，从制药公司和技术提供商到治疗药物开发商以及慈善机构。
PAT联盟的一个目标是在降低成本和投资风险的情况下，作为一种催化剂，加速发展必要的知识和理解。
Harrison指出:“通过降低这些技术的准入门槛，我们希望更多的公司能够利用这些技术。” PAT联盟的建立是该领域第一个大规模的传播活动，但其它“令人兴奋的未来合作”也是可以预期的。”通过这些努力以及整个行业的努力，我们希望看到供应商能够提供更多针对细胞和基因治疗的设备，降低所有细胞和基因治疗公司在他们的工艺中利用这些技术的门槛。”
活跃的研究领域
龙沙和诺华等公司正在不断评估潜在的新技术，这些技术可能克服细胞和基因疗法工业化所面临的挑战。Jaluria指出:“PAT是一个活跃的研究领域，许多公司都希望在未来几年推出自己的解决方案，以解决当前所面临的许多瓶颈。”
Rossetti指出，使用微流控系统进行自动化蛋白质分析(ELISA、Western Blot)可以让操作人员在同一测试运行中分析更多的样品，从而减少时间和成本。尽管如此，她警告说，尽管这些新的自动化技术显示出了良好的应用前景，但它们的开发必须进一步推进，以确保符合GMP法规要求。
Nirrin Technologies专注于开发基于近红外(NIR)技术的PAT解决方案，以解决特定的行业问题。Hassell解释道:“我们将NIR光学传感器与机器学习相结合，以实现下一代的上、下游传感器解决方案。”他指出，公司专注于未被满足的最大需求，包括易于使用、稳健、准确的葡萄糖、VCD/TCD和滴度检测，而重点是使用艾默生的DeltaV分布式控制系统进行控制系统集成。
真正实时监测的希望
最终的目标是实时监测方法，其可用于上、下游工艺，且仅需要极低的样品体积，并实现核酸（RNA、DNA）和蛋白质目标物的全面表征，并且可以与单元操作的控制软件匹配，允许进行简单的数据分析。
“在最深层的层面上，”Hassell说，“我们需要足够的组学内容来理解细胞的功能、特性和质量。例如，蛋白质组学和转录组学结合细胞因子/趋化因子分析。结合更多宏观性质的数据，如细胞数量定量、病毒滴度以及病毒载体的完整-vs-空状态，这种类型的解决方案将支持最终的生产平台。”
CGTC的目标是鉴别新技术和/或对于该领域是全新的那些技术，以解决行业中的过程监测挑战。“在这方面，我们并没有对特定的技术有倾向性，只要它们能帮助我们测量已确定的CPP和CQA，”Churchwell评论道。
Friedrich Ben-Nun希望实现的特定PAT解决方案包括：在细胞生产过程中监测生长因子的快速实时方法；实时鉴别细胞类型杂质的方法，如在生产过程中未成熟或未分化的细胞；实时监测细胞特征变化(细胞形状、核-质比、激素分泌等)的方法，以作为工艺成功的指标；实时监测病毒颗粒数、聚集和基因组的方法；基于生物标记物的方法，以关联或预测产品效力；病毒载体纯化过程中快速实时鉴别杂质的方法；以及自动化采样系统与针对性分析解决方案的整合。
对于载体生产过程，Rossetti说，采用微流控技术对p24衣壳蛋白进行定量的快速ELISA分析测试可以帮助立即了解生产产量，并决定团队是否应该继续进行下游工艺。她还指出，对下游工艺过程中与工艺相关污染物进行实时分析也很有价值。对于细胞治疗，Rosetti也认可PAT系统的应用，其不仅需要可以分析活性，还可以分析免疫表型，以更好地表征细胞亚群，并评估最终输入患者的产品的分化水平。
理想的时间
随着该领域的不断成熟，细胞和基因治疗生产将从PAT技术的进步中获益，而后者可能是针对传统生物药的哺乳动物生产而开发的。Friedrich Ben-Nun说:“对用于生物药哺乳动物生产的工具进行微调和优化，对将PAT用于细胞和基因治疗生产至关重要。”她补充说，尽管如此，为了支持细胞和基因治疗不同的工艺路径，将需要开发针对细胞和基因治疗生产的新的PAT解决方案。
Jaluria同意在细胞和基因疗法的生产中，使用在线和非破坏性分析的空间有很大的机会。Hassell进一步说道：“这是细胞和基因治疗中PAT的理想时机。它将开始取得成功，因为围绕ATMP的大量研究和令人兴奋的事件，将推动新一代生物传感器的发展。”
原文：C. Challener,“Process Analytical Technologies for Manufacturing Cell and Gene Therapies,”BioPharm International 34 (12) 10–14 (2021).
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