AAV生产的挑战：工艺差异性、过程中表征以及药物产品质量的相互影响
本文节选自来自Capsida Biotherapeutic发表的文章“Challenges in AAV manufacturing: the interplay of process variations, in-process characterization, and drug product quality”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
工艺差异性及对产品质量的影响
生产 & 纯化工艺差异性
生产腺相关病毒载体(AAV)的上游工艺主要包括三个部分：
生产细胞系的扩增； 引入基因成分，以制造病毒载体；以及 从生产细胞组分中收获和分离载体。
虽然该领域正在向悬浮平台发展，但仍有许多生产工艺是以贴壁培养进行的。两个平台都需对参数进行控制和监测，以确保扩增过程中的一致性。
细胞扩增后，加入基因成分，一场复杂的“舞蹈”就开始了。这是一个复杂的级联反应，涉及由质粒或辅助病毒提供的辅助序列、AAV复制基因以及细胞蛋白的募集，以便从载体DNA结构拯救和复制AAV反向末端重复和包装序列，以及衣壳蛋白的表达，从而形成包装治疗性基因的基因治疗载体。表1总结了目前使用的各种组分和方法。除了在目标细胞系中诱导生产的机制有很大差异外，载体的收获时间也很宽泛，从开始生产后的2- 7天不等。载体可以仅从细胞、上清液或两部分培养物中获得。考虑到载体产生方式的较大差异以及生产级联的复杂性，需要理解过程变化的影响以及不同公司和产品类型之间产品表征的差异性并不令人惊讶。
选择生产平台的一些关键考虑因素是产品质量和可放大性。比较生产方法的初步研究表明，与瞬时转染相比，杆状病毒-sf9产生的物质的感染性降低，而单纯疱疹病毒(HSV)产生的物质的感染性增加。对杆状病毒-sf9系统中AAV包装基因的优化可提高AAV载体的感染性，表明修饰辅助基因和AAV基因本身可以显著影响生产产品的质量。这在转染系统中得到了进一步证明，与野生型AAV2序列相比，对辅助基因或Rep基因的修饰，包括使用来自其它AAV血清型的Rep序列，提高了整体生产力、完整衣壳数量以及载体感染性。在Rumachik等人最近发表的一篇文章中，对HEK293细胞质粒转染产生的AAV载体进行了表征，并与杆状病毒转导Sf9细胞产生的AAV载体进行了比较。在生产力、基因组甲基化和翻译后修饰方面有明显的差异，HEK293产生的物料在体外和体内都有增强的效力。此外，从细胞纯化的载体与上清液相比，在体外载体性能上可观察到微小但显著的差异。这种趋势在各个细胞模型中并不一致。总之，这表明生产过程的所有三个部分对载体的性能有重大影响。
上游生产工艺可能只有三个主要步骤，但每个步骤都有多个工艺参数，这些工艺参数可能会影响产品质量。当一家公司开发一个项目时，他们必须在开发周期的早期定义这些工艺参数并选择一种生产方法，以满足预期的临床需求。根据项目的不同阶段，可以采用不同的生产方法，例如临床前、早期临床和商业化阶段。在这些阶段中生产方法的改变可能会导致产品质量的变化，从而使不同研究的数据转换具有挑战性。例如，在某些杆状病毒-sf9系统中，可以观察到ITR和包装序列的基因不稳定性，且仅在5个连续传代中就可以观察到，这会导致产品的潜在差异，包括在同一系统内规模放大和长期生产中的生产力和感染性。这将需要产生足够的起始物料，以允许低传代杆状病毒在整个项目的生命周期内存留，或在项目后期生产的风险物料表现显著不同。在资源有限的早期项目中，最好将开发工作集中在更有影响力的工艺表征上，从而产生一些与规模相关的产品质量变化，以期在产品生命周期的早期被发现。
目前AAV纯化的标准方法通常包括收获料液的澄清，将载体颗粒从宿主细胞污染物和工艺试剂中分离出来，富集完整的衣壳，并将富集的载体缓冲液置换成稳定的基质，以达到患者给药所需的浓度。Ayuso等人总结了建立一种用于多种AAV血清型的AAV纯化工艺平台所面临的挑战。对于完整衣壳的富集，对于新型衣壳更灵活的步骤，如梯度超速离心，通常在GMP环境中表现出较差的可放大性和可重复性。相比之下，由于载体的电荷或等电点不同，以及包装的转基因的大小不同，开发一种适用于不同衣壳或血清型的通用层析富集方法可能很困难。这可能对生产和纯化广泛的AAV血清型或修饰衣壳的公司或合同制造组织构成挑战。普遍应用的方案显示具有宽泛的浓缩倍数范围，相比上样的待纯化物料和血清型，达到完整衣壳的2 –8x不等。这使得在没有对纯化和富集方法进行大量开发和优化的情况下，在多种血清型和/或转基因组合中实现同等质量具有挑战性。
这种开发上的困难可能导致许多小组开始他们的临床前和I期项目时，使用基于离心机的纯化方法，而可放大的、基于层析柱的纯化方法在临床生命周期的后期阶段才开发和实施。这些精纯和浓缩步骤的变化可能导致杂质的含量显著不同，包括空的或部分填充的衣壳，或污染性宿主细胞蛋白质或DNA。如果没有一个可靠的分析工具包，这些差异往往会使证实从早期到临床研究产品的可比性变得非常困难，因为不仅要比较产品的整体质量，还要比较不同包装的DNA以及衣壳含量对目标群体的感染性和效力的影响。
总之，生产和纯化方法以及相关产品质量的这些差异突显了需要更可靠的分析方法，将工艺变化与其对产品质量和载体性能的影响联系起来，尤其是在开发的早期阶段。随着越来越多的项目和公司寻求规模放大和商业化他们的产品，这些方法对于理解这些过程变化对载体性能的影响至关重要。对这些差异的理解会因为衣壳血清型的差异性和所利用的修饰，以及在开发的早期对关键质量属性的有限定义而变得更加复杂。随着AAV基因治疗继续成熟，在分析方法不可用或产品质量属性尚未完全鉴定的情况下，一家公司如何针对工艺变化做出明智的设计决策将需要标准化，以确保载体性能不受生产更改或工艺规模放大的影响。
过程中储存步骤 & 分析检测
在早期阶段，只进行了有限的研究，以评估储存步骤和生产过程中使用的制剂的影响及其对终产品质量的影响。Bee等人最近报道，通过荧光染料游离DNA分析，在离子交换以及随后的每次冻融循环后，药品中游离DNA都有所增加。虽然DNA释放的绝对量相对较低，但这表明了在不同的存储温度、时间和每个储存步骤的缓冲液条件下对载体产品进行表征的重要性。离子交换后释放增加的原因推测与低渗透压和更高pH有关。这与冻融循环过程中游离DNA的增加原因不同，后者可能源于衣壳的降解，这指明了导致最终产品质量差异的原因存在多种机制。不同的AAV血清型在较低的pH条件下表现出不同的衣壳稳定性和转导效率，这与储存温度有关。由于许多亲和洗脱步骤依赖于低pH洗脱，在这一步中，洗脱缓冲液、中和缓冲液、中和方案以及储存的差异应该被严格评估。由于许多当前使用的分析方法的准确性受到纯化过程中使用的缓冲液的影响，或者需要高纯度的产品来提供关于载体的精确结果，因此评估这些差异的能力可能会进一步被复杂化。这限制了在过程中测试期间以代表性状态表征样品的能力。
检测AAV和药物产品关键质量属性的方法已经被描述和细化，因为更多的研究数据已经被开发出来。以过程中样品检测AAV依赖于将这些针对纯化的药物产品所开发的分析工具应用于具有不同pH和盐含量、大量宿主细胞蛋白质、部分形成的衣壳和残留的质粒DNA的复杂基质，这限制了报告数据的可靠性。由于有大量的方法被用来检测相同的产品属性以及它们在过程中哪个阶段可以被利用的差异性，因此很难定义过程变化(特别是在上游)对最终产品质量的影响。最近的一项研究比较了多种HPLC方法，证明了分析柱和包括紫外、光散射和固有荧光的分析方法的组合的效用，以检测DNA污染、完整和空颗粒的产生，以及从未纯化的澄清裂解液样品和纯化产品中检测部分包装的衣壳。其它方法也已经开发出来，通过将目前用于AAV表征的多种方法结合到一个单一仪器中，以最小的样本操作，监测一系列产品属性，包括允许评估衣壳和基因组滴度、聚体以及完整和空衣壳定量。遗憾的是，许多这些方法仍然需要相对纯化的样品来进行分析。
药物产品制剂 & 长期稳定性
许多已知的、对于AAV载体制剂至关重要的因素来自关于AAV2或其它常见血清型的已发表文章、蛋白质或单克隆抗体领域的知识、或者少数几个已商业化AAV产品的有限数据。已知大多数AAV在衣壳浓度介于1-10x 10^14衣壳/mL之间时会发生聚集，尤其容易在低离子强度缓冲液中聚集。Wright等人的研究也表明，不同的纯化方法可能会共纯化工艺相关杂质，这些杂质可能有助于提高过程中和最终产品中的聚集，进一步证明了生产和纯化工艺可以改变我们对药品稳定性的理解，在进行规模放大或商业化的工艺更改时应考虑到这一点。一些衣壳还显示出了pH依赖性的蛋白酶活性，可导致衣壳蛋白的裂解。这突显了早期评估制剂缓冲液应用于新的血清型或新的衣壳修饰的情况的重要性，以确保某些制剂缓冲液中可能发生的小pH值或离子变化不会在产品储存、运输或操作期间导致重大的产品质量变化。AAV药物产品的制剂取决于给药途径，但主要是确保缓冲试剂的组成可维持pH (通常是Tris或基于磷酸盐)、盐离子达到目标离子强度，以及泊咯沙姆减少衣壳非特异性结合到管或瓶。AAV已被证明可在<-70°C下稳定储存2年，但在多次冻融以及在+2 - 8°C下延长储存后，可观察到多种血清型的体外和体内性能下降。如需提高冻存条件中的稳定性，一些制剂中还可包含冻存保护剂，以降低聚集，提高衣壳在冻融条件下的稳定性。虽然仍在继续进行研究，以允许在低温条件下存储和运输，但目前的最佳实践使用长期冻存制剂，以及在产品解冻和制备后在+2-8°C的有限货架期。这给供应链和临床站点带来了负担，以维持足够的冷冻储存，限制了AAV产品的货架期，给基因治疗的广泛应用带来了障碍。
总结
随着AAV产品临床试验数量的不断增加，生产实践也在不断发展，以满足产品需求。如果没有完全理解不同血清型或衣壳修饰之间的联系、生产和纯化方法的影响以及确定病毒载体性能的关键属性，临床研究在试图了解临床前、早期和晚期临床研究之间的差异时会陷入停滞。其中一些原因可以归结为：
用于生产AAV载体的生产和纯化工艺有许多差异性。对可接受的工艺参数或关键工艺或产品质量属性的理解通常基于可能用于不同血清型或具有不同工艺参数的相似产品的相似生产方法。对于最优AAV载体质量的关键工艺步骤，目前的行业共识有限。
目前的分析方法和标准通常是针对纯化的药物产品开发和验证的，这使得了解过程中变化对更细微的产品特性(如部分基因组包装或衣壳表面修饰)的影响难以确定。更好地理解对临床性能有重大影响的产品特性可以帮助指导方法开发，以了解哪些工艺步骤对AAV载体至关重要。
来自行业和政府机构的倡议，例如开发多种血清型的参考标准品，以及建立诸如定制基因治疗联盟这样的合作伙伴关系，正在为更好地转化关于AAV载体产品质量和性能的可用数据铺平道路。多种策略已经被提出并发表，将质量源于设计应用于AAV生产领域，并将继续加速对这些基因治疗产品的理解。
原文：D.Chu, H.Archarya, E.Springfield, et al., Challenges in AAV manufacturing: the interplay of process variations, in-process characterization, and drug product quality. Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(9), 1231–1237.
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