细胞治疗制造的进化 - 早期和现在的程序
本文节选自《The Evolutionof Cell Therapy Manufacturing – Early Days and Present - Day Procedures》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
虽然细胞治疗(CT)经常以一个短语被不经意地提到，但实际上它指的是相当广泛的医疗治疗。在欧盟，它们可以被称为基于细胞的药物产品(CBMP)，一种先进的治疗药物产品(ATMP)。在美国，CBER继续在试图阐明基于人类细胞和组织产品(HCT/P)以及细胞治疗药物产品(CBMP)等概念，这涉及最小操作、其它成分组合、系统性效应以及代谢活动依赖等因素。
治疗方法的区别包括自体和异体方法；所用的细胞类型；所需的任何激活、转导或工程处理；细胞培养方式；以及治疗的适应症。我们都知道在治疗中使用的T细胞和多种干细胞。但事实上，许多先天或获得性免疫细胞因吞噬活性、抗原呈递能力、灵活的表型或组织迁移等特性，现在被视为治疗药物。仅从外周血中获得的细胞就包括了T细胞、自然杀伤细胞(NK)、诱导多能干细胞(iPS)、巨噬细胞、γ -δ T (g∂T)，骨髓浸润淋巴细胞(MILs)和肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)以及造血或间充质干细胞。
其中一些已经通过病毒转化或CRISPR-Cas9等手段被改造成多种治疗技术，如嵌合抗原受体(CAR) T细胞，现在甚至已经到了二聚抗原受体 (DAR) T细胞阶段，并被应用于多种炎症和增殖性疾病的治疗。一般来说，细胞疗法的实际生产，虽然规模较小，但比生产单克隆抗体等蛋白质生物制品更复杂，需要更多的人力操作。
在这个系列的文章中，我们将介绍细胞治疗制造的进化，包括细胞治疗是如何开始的，以及早期细胞工艺程序。然后，我们将看看细胞治疗制造的目前状态以及目前的方法。之后，我们将讨论改进当前工艺的机会，并探索未来的细胞治疗制造，这将使该行业真正进入未来。
早期
毫不奇怪，细胞治疗工艺向商业化规模生产的转移开始得相当“笨拙”。首先，即使是对于干细胞和CAR-T细胞等先进疗法，其细胞培养、修饰和扩增的方案开始于20世纪80年代末，当时的技术，以今天的标准来看，是相当原始的。这些早期方案的特点是手工标记、手动分配、基于纸张的数据跟踪，以及有限的分析和通常没有被很好使用的数据池。由于这种“工艺就是产品”的心态，不可避免地减缓了更新的工程技术与细胞培养工艺的整合。
例如，Rosenberg早期获得性转移疗法中使用的TIL的生产过程，其特点是内部生产物料，在高度专业化的医疗中心实验室的生物安全柜中进行操作。这里，非冷冻保存的患者肿瘤切片通常被切成小块，在酶混合物中孵育，收获的浆液通过金属筛网过滤以去除组织块。从滤液中分离TIL，采用步骤Ficoll梯度，然后在含有IL-2的24孔板中手工传代。之后将TILs在T瓶或塑料袋中扩增，有时与条件细胞培养上清液或与辐照饲养细胞共培养。
目前状态
虽然骨髓移植可能被认为是最成功的细胞疗法，但在最新开发的基于细胞的免疫疗法中，临床应用最先进的是干细胞和CAR-T。大约十年前，在CAR- T中，我们开始看到不仅出现了新的抗原受体工程技术，而且出现了CAR疗法中招募的细胞类型。同时，我们也看到了细胞工艺设备、分离和扩增方法、分析和超低温保存技术的重大发展。
目前，有些方法有可能在医疗护理点进行工艺处理，但许多产品目前倾向于集中生产的方法，即将单采或活组织检查的物料以新鲜或冷冻方式运送到集中生产地点。在这里，细胞产品被制造、冷冻保存并冷冻运送到诊所，用于输注到患者体内。
细胞疗法制造工艺和设备的许多方面与其它生物制品非常相似。例如，在生物反应器中，用于免疫豁免MSCs等异体细胞治疗的细胞扩增与用于疫苗的哺乳动物细胞培养非常相似，其前者最终可能需要与后者类似规模的生产。然而，其它方面则截然不同。以细胞为基础的疗法的一个特点是，最终产品可能不能像在单克隆抗体或酶生产中那样进行除菌过滤。随着个体化细胞疗法的发展，对其生产的考虑也变得更加多样化。在隔离、密封和工厂内物料流动方面的要求可能导致工厂重大的设计变化。例如，对多个患者样本或感染性物料的隔离可以决定实际的隔离要求。
一般生物制造工厂要求
更衣间：人员气闸(PAL)和物料气闸(MAL)
ISO分级和cGMP符合性
HVAC、空气供应和气流模式
湿度和湿度控制
环境监测
无菌工艺需求
污染物和微粒控制
关键公用设施(以及冗余或备用电力)
工艺设施(注射用水、二氧化碳、压缩干燥空气等)
工厂的规模(视乎所需的功能及外包)
自体或异体及其相关的生产工艺布局
所需专用设备(如：生物反应器、离心机、低温保存)
细胞治疗中通常采用的设备
二氧化碳，湿化细胞培养箱
基于抗体的细胞分离设备
专用细胞处理/培养/生产系统
生物安全柜和/或无菌隔离器
qPCR、流式细胞仪或ELISA/PAGE
离心机，支持白细胞分离
实验室显微镜
γ辐照器
流式细胞分析仪
支持这些疗法的CBMP的制造可能需要以下操作功能：专门的接收和运输、先进的保管和跟踪/追踪链、特殊的监管考虑、独特的自动化一次性使用系统、开放或封闭式系统处理、低温保存、大规模或多个小规模细胞培养操作。现在可以采用宴会厅式布局，过程自动化，独特的培养或下游工艺以及先进的实验室检测。操作车间设计需应对工艺所需的清洁和消毒，其环境分类遵循产品的性质和所使用的工艺设备。细胞治疗工厂设计需要仔细考虑基于科学的安全性和监管标准。例如，在建立车间规范时，因为在无菌密封隔离器内进行工艺操作，封闭和自动化工艺允许减少车间分类。
在过去的几年中，CBER的OTAT (组织和先进疗法办公室)和EMA批准的细胞和基因治疗产品数量不断增加，审查中的提交数量也大幅增加。虽然在商业规模的制造方面提出了一些相当大胆的倡议，但对许多人来说，在工艺放大、车间设计和工厂架构方面往往仍保持保守的方法。下面是当前操作的一些工艺类别的概览。
样品接收
对于自体治疗，接收、编目和管理数百个独特的患者细胞“货物”需要专门的工艺和设施。处理这类疗法的第一步是将样本从置于不受控制环境中可能受污染的运输容器转移到置于受控环境中的无菌设备中。在运营的早期，我们并没有考虑较大的体积，即使每年2000批也只相当于每天几批，尽管这种情况预计将很快改变。
培养基制备
使用液体或粉末状培养基和缓冲器的工厂是非常不同的。大规模培养的粉末状培养基需要有能够处理粉末配方和过滤的车间。此外，对于生产中使用的封闭和/或集成式系统，还需要有对无菌流体进行QC检测、转移和分配的空间。如果使用的液体产品在规模合适的容器中(这是目前规模条件下生产的常见情况)，上述任何一个都不需要，但必须为其存储和组织设计足够的冷藏空间。
载体生产
对于需要载体的工艺，目前在基因载体的选择、生产方法和生产地点方面有许多选择。它们包括各种来源的裸DNA和纳米结构、电穿孔、微流体以及使用哺乳动物和昆虫细胞生产的重组病毒载体。很少有细胞治疗开发商有能力、专业知识或资源来制造病毒载体，这就是为什么第三方合同制造市场不断增长的原因。行业已经在多重重组“生产”细胞系上进行了大量的工作，但这一领域的工作仍需继续，以取得实际的成功，病毒载体仍然是目前最多选择的方法。虽然存在许多病毒载体/动物细胞系，每个都有自己的优势，对于细胞治疗应用，HEK293生产的慢病毒和AAV仍是目前最流行的。
病毒载体生产的工厂要求与某些疫苗生产基本相同，只是具体规模、车间分类以及下游工艺链配置可能会有不同。纳米颗粒病毒、腺病毒、慢病毒和AAV的正式BSL分类会有差异。病毒的BSL分类因素包括1)病毒科和亚科，2)任何插入的重组基因，3)生产手段(如辅助病毒)，以及4)任何工程衰减。例如，早期针对慢病毒的个别工作必须至少在BSL-2、增强BSL-2或BSL-3下进行。AAV一般可以在BSL-1条件下处理；但是，如果包含了某些转基因，或者在生产过程中使用了辅助病毒，则可能需要BSL-2环境。出于这些原因，同时也是为了提供适应工艺或病毒更改的灵活性，许多开放商默认采用更高的BSL级别。已经有机构、联盟或委员会提出了环境要求和方法，如NIH的重组DNA咨询委员会(RAC)在诸如“慢病毒载体研究的生物安全考虑”的文件中所列的内容。
临床试验中的大多数载体是病毒来源的，尽管一些开放商正在开发诸如由合成的靶向纳米颗粒递送的基于转座子的载体。显然，每个系统决定了它自己的生产工艺和要求。直到最近，许多病毒载体的生产都需要在多层托盘式静态塑料器皿、滚瓶、多层细胞工厂、基于微载体的搅拌罐生物反应器或可放大的固定床反应器中进行贴壁细胞培养。但这种情况正在改变，如今用于生产病毒载体的大多数细胞系都在被尝试进行悬浮驯化。此外，对无菌性、可再现性和生产人员安全的要求，正在推动半封闭、半自动化生产工艺的发展。
虽然使用悬液驯化的细胞系可以获得高滴度的载体，但据报道，在>200L规模时，悬液细胞的瞬时转染存在不小的挑战，而且使用更大规模的悬液细胞的方法尚未被广泛用于常规的载体生产。
治疗性培养扩增
细胞扩增的目标是建立一个简化、稳健且符合GMP的方法。对于不同的细胞治疗产品，具体的步骤会有不同，治疗方法的实施也会不同，我们可以看到市面上有不同的细胞培养方式。例如，在CAR-T工艺中，我们看到的过程包括1)培养选定的单采患者细胞，进行活化和转化，2)扩增活化和转化的患者细胞，3)在某些情况下，扩增的患者细胞与辐照的抗原表达饲养细胞系共培养。
显然，这种多个处理步骤的方式可能会变得相对复杂。这对有效性和可重复性至少提出了两个挑战。首先，由于原代患者细胞样本是独特的，并且在多个参数维度上存在高度可变性，因此该工艺必须是动态的，并能对特定培养的特性和性能做出响应。其次，每一步都有单独的潜在操作错误风险。因此，开发商和合同合作伙伴正致力于开发更优化、更自动化的方案和设备。这将有助于降低成本和错误风险，同时提高标准化和可再现性。
有些细胞治疗涉及悬浮(如CAR-T)和贴壁细胞培养(如间充质干细胞/间质细胞、成纤维细胞和成肌细胞)。在之前的文章中，已经对两种系统中工作的复杂性进行了充分的讨论。此外，行业也希望通过基于灌流的培养系统，强化该工艺。
在用于异体方法的免疫豁免细胞的大规模 (大于几升或多层瓶) 培养中，我们希望看到在蛋白质生物生产中熟悉的上游车间和设备，其将采用熟悉的主细胞和工作细胞库、培养扩展链、大规模培养和过程监控控制方法。在自体细胞治疗中，患者特异性细胞的个体化源性和特征，以及非常小的培养规模(<20L)是最显著的差异。最后，我们现在已经看到商业化分布式半自动化培养工具的广泛采用。
基于一次性使用系统的工艺已经很常见，其使用无菌的一次性使用烧瓶、瓶子、袋、管路套件、过滤器组，甚至是自动化的系统。这些部件通常体积庞大，因此需要专门的存储空间，以避免过度堆积以及相关的损坏风险。整体生产过程污染控制策略(CCS)的一个关键方面是在组装前和组装期间对部件进行处理、准备、相关的消毒和检查。对于关键操作，如药品灌装，准备和装配应在高分级的环境中进行，这可能与最终操作的区域不同。在这种情况下，将组装好的部件转移到使用区域以及相关的消毒制度(例如，手动、VHP表面生物净化气闸)将是至关重要的，应在CCS中加以确认。
商业化细胞治疗设备示例
分析
细胞、病毒和核酸的定量和分析在许多平台上都是必需的，而且往往需要使用相当新型的设备。然而，除了可能有一个支持该功能的额外安全分类 (即BSL-2)车间之外，通常没有什么独特或显著的设计属性。来料的质量控制过程与蛋白质生物制品完全一样。与小分子或蛋白质生物药相比，活细胞产品的过程中和21CFR最终产品质量控制以及放行检测可能会相当独特，需要建立诸如细胞数量和活性等的生产参数值，此外，还包括产物相关杂质值、载体能力、细胞CD标记以及CAR表达。但是，除了占地之外，常用的qPCR、流式细胞术或ELISA/PAGE分析不会对工厂或车间的设计或服务带来任何挑战。此外，病毒载体的表征和定量手段也已经有了很大的进展。
低温贮藏和运输
细胞治疗的细胞材料和产物的转移通常需要低温保存。无论是将采集的患者细胞运到生产现场，还是将经过处理的药物成分送回诊所，都需要同样的“无缝”运输方式。集成式、一次性使用冻融系统可以提供所需的效率和稳健性，因为对于此类应用，可能很少有物料或时间可用于第二次尝试。针对大规模的异体细胞工艺，已经建立了支持产品半自动化制备的工厂。对于自体治疗，这涉及到高度控制的小瓶或冻存袋的配量和贴标。将针对单个患者的产品体积或具有其它特性的特殊批次自动化灌装到单个冷冻袋中是很困难的。
自动化、半自动化和机器人
自体治疗，尤其是传统的自体疗法，需要许多有技术经验的操作人员。由于许多操作都是在容易发生人为错误的开放式系统中进行的，因此需要经常进行培训。商业化半自动化系统的推出，甚至用于细胞治疗的机器人，都极大地提高了操作的安全性和效率。
工厂灵活性
大多数新工厂采用专利的模块化洁净室系统。许多模块化设计包括墙壁和天花板系统以及冲齐平安装的面板，支持方便的组装和拆卸以及所需的清洁和消毒。工作环境分类遵循产品的性质和所使用的工艺设备。现代化工厂设计需要仔细考虑基于科学的安全和监管标准。封闭和自动化的工艺将需要数量显著降低的车间分类，就像在无菌隔离容器中操作的工艺一样。
总结
细胞治疗的制造工艺起源于几十年前的早期程序，使用的是我们现在看起来相当原始的技术和设备。而目前的方法有些不同，成熟的开发商会采用一些最新的细胞分离、工程、分析和半自动化培养方法。我们正处于一个日趋成熟的阶段，有许多申请，一些重要的批准，以及令人兴奋的新生产技术和设备设计选择的承诺。
原文：W.G.Whitford, The Evolution of Cell Therapy Manufacturing – Early Days and Present-Day Procedures. 2021, https://cellculturedish.com.
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