新型生物治疗药物中的膜技术：质粒DNA
本文节选自《New developments in membranes for bioprocessing – A review》。详细内容，请查看原文。更多本文相关内容，请查看“连续生物工艺：灌流生物反应器”。
基因治疗是指使用DNA(或RNA)替换、失活或修饰一个或多个基因。基因治疗的早期关注点是治疗以单一基因缺失或功能紊乱为特征的遗传性疾病，例如，在治疗血友病时引入一种编码所缺失凝血因子(最常见的因子VIII)的基因。然而，也有可能使用基因疗法来治疗癌症，如使用基因工程T细胞。此外，DNA和RNA都可以用作疫苗。在后一种情况下，核酸提供了目标抗原的“原位”生产，然后刺激病人的免疫系统。
DNA可以用病毒或非病毒载体递送到目的细胞。非病毒载体包括一系列的聚合物、肽、纳米颗粒和脂类。DNA本身以质粒的形式存在，质粒是一种小的染色体外DNA分子。质粒可以以三种拓扑亚型中的一种存在：超螺旋、线形和开环(或带缺口的)。当质粒通过DNA的酶“缠绕”产生时，就产生了超螺旋亚型；这是最具有治疗作用的形式。开环亚型由一条DNA链断裂(称为“缺口”)产生，而线性亚型由两条DNA链断裂产生。线性和开环亚型被认为是工艺杂质，必须按照FDA指南将其减少到总DNA的20%以下。这是一个特别具有挑战性的分离，因为不同的DNA亚型具有相同数量的碱基对和碱基序列。
膜系统对于质粒DNA的纯化特别具有吸引力。Manzano等研究表明，TFF可用于质粒DNA的初始纯化，将宿主细胞蛋白等小杂质洗过膜，进入滤液而去除。Latulippe等表明，较大的质粒(回转半径50至200nm)通过相对较小孔径的超滤膜(孔隙半径5至15nm)取决于在接近膜孔的收敛流畅中质粒DNA的伸长。在低滤液通量下，DNA保持高度螺旋状，无法进入小孔。由于拉伸力的增加，当滤液通量增大时，DNA会伸长，形成取决于膜孔径大小的滤液流量临界值，但其基本上与DNA大小无关(即碱基对数量)。
图1：DNA在膜孔入口处收敛流场中的拉长。左面-低滤液通量。右面-高滤液通量。
由于这些DNA分子伸长弹性的不同，对于超螺旋、开环和线性亚型，透过的临界滤液通量是不同的。线性亚型具有最低的临界通量，因为它最容易拉伸，并与进入膜孔的液流流线匹配。由于开环结构的弯曲“刚度”，开圆拓扑结构具有最大的临界通量。Latulippe和Zydney利用这些差异开发了用于纯化所需超螺旋DNA的膜过滤工艺。典型的结果显示在下图的琼脂糖凝胶图中，实验使用3.0 kbp (千碱基对) DNA，使用动态光散射测定的有效半径为73 nm。在10 μm/s (36 LMH)的通量下，所有3种亚型都被膜完全截留；这些条件对于DNA的初步浓缩是合适的。将滤液通量增加到27 μm/s (97 LMH)，可使线性质粒进入滤液中而被去除，但超螺旋和开环异构体在截留液中被回收。在更高的滤液通量(55 ~ 85 μm/s)下(介于两种亚型的临界通量之间)，可以将超螺旋同开环结构分离。不过需要注意的是，这些数据是在≈1 mg/L的稀释溶液中获得的；较高DNA浓度的实验往往会导致膜污染，尽管可以使用反脉冲来减少这一情况。Li等人研究表明，使用带有“锥形孔”的膜可以在超滤膜的紧密选择层之前预拉伸DNA，从而进一步提高性能，即有机会开发具有专门设计用于DNA纯化的定制膜孔几何形状的膜。
图2：琼脂糖凝胶显示3.0 kbp质粒DNA的超滤分离。1和8号栏为线性DNA阶梯。2和3号栏为滤液通量36 LMH时采集的滤液样品；4号栏是在此条件下最后的进样样品。5和6号栏是滤液通量97 LMH时采集的滤液样品，显示线性亚型，7号栏是在此条件下最后的进样样品。
原文：A.L.Zydney, New developments in membranes for bioprocessing – A review. Journal of Membrane Science, 2020, https://doi.org/10.1016/j.memsci.2020.118804.
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