理解系统差异对参数评估和高通量层析数据规模放大的影响
本文节选自来自伦斯勒理工学院和阿斯利康的研究人员发表的文章“Understanding the effects of system differences for parameter estimation and scale-up of high throughput chromatographic data”,由于水平有限,详细内容,请参考原文。
摘要:在本文中,我们评估了使用RoboColumns® 进行馏分收集和多步梯度如何影响与台式实验数据和层析柱模拟参数估计的比较。这些操作上的差异来自于RoboColumn®系统(在自动液体处理设备上操作)需要离线分析以确定洗脱液图谱,而不是在大型系统上所获得连续在线UV曲线。此外,由于使用连续注射提供液流,多步梯度被用于建模大型系统的平滑线性梯度。研究首先进行了两组层析柱模拟的比较,以证明馏分收集使洗脱峰的一阶矩降低1/2馏分体积。额外的层析柱模拟结果表明,多步梯度近似对保留体积的影响取决于梯度步长。然后,开发了一种经验转换,以校正使用RoboColumn®系统的梯度实验数据所获得的一阶矩。这些校正值提供了一个针对不同规模下实验数据更直接的比较,显著优化了与20mL实验室规模层析柱获得的结果的符合性。然后利用校正后的值估计线性空间质量-作用(SMA)参数,并利用这些参数成功地预测了台式系统数据的性能。最后,如适当地考虑了多步梯度和馏分收集,这些参数被证明非常适合建模RoboColumn®梯度数据。这项工作继续了我们之前的研究,以了解与机器人液体处理设备相关的系统差异,并提出了一种方法,以适当地计入操作差异,用于预测使用传统层析系统在更大规模下的操作。
简介
微型层析柱已成为促进下游工艺开发的重要高通量工具。Lacki对微型柱和其它高通量形式进行了深入的研究。与更传统的高通量筛选系统相比,如过滤板和微量移液吸头,微型层析柱可以更接近于传统的层析系统。Weirling和同事利用这种相似性及其高通量能力,结合质谱监测,评估了Protein A亲和层析的宿主细胞蛋白清除。尽管通过已建立的实验性规模缩小模型,微型层析柱的可比性有所提高,但在操作和系统方面仍存在差异,在用作传统实验室规模层析缩小模型时必须适当考虑。最值得注意的是,在微型系统中,使用离线分析的馏分收集替代了在线UV监测以及线性梯度的多步近似,在实验期间的间歇液流是在层析工艺中使用高通量微型系统与传统设备的典型差异。
多项研究比较了微型层析柱与常规应用的台式系统的性能。Weindahl和同事在针对层析柱流穿和洗脱曲线的实验设置中观察到了相似的结果。Treir和同事使用自动液体处理装置,将微型层析柱用于纯化工艺的规模缩小。在这项研究中,在层析柱体积方面提出的实验结果在微型柱和实验室规模柱之间具有可比性。我们小组之前的工作证明了线性梯度洗脱的可比性,并研究了由于不同洗脱液流穿曲线而导致的蛋白质混合物步骤洗脱的细微差异。
微型柱也被用于层析柱的建模。Susanto和同事比较了使用ӒKTA系统 (Cytiva) 获得的传输参数,以操作微型和标准层析柱。在此项研究中,当使用两种层析柱进行流穿实验以评估轴向分散和集总动力学速率系数时,从独立的批次吸收实验评估了等温参数。在微型层析柱中,这两个系数被确定为更大。这项工作后来继续发展了一种基于模型的工艺开发方法。Osberghaus和同事利用微型柱估算了等温参数,同时从传统的台式系统中获取传输参数。我们已经证实了一种参数估计方案,仅使用微型柱来确定等温和传输参数,然后用于预测台式线性梯度性能。当适当考虑洗脱液流穿趋势时,这项工作被扩展到预测步骤洗脱性能。
在本文中,我们扩展了我们先前开发的实验数据比较和参数评估方案,以评估馏分收集和多步梯度近似的影响。我们首先使用由机器人液体处理器和RoboColumns®组成的系统的数据,并将其与更大规模的台式系统(体积放大约33倍)进行比较。进行了两组层析模拟以预测由于馏分收集和多步梯度导致的峰洗脱一阶矩的差异。根据这些结果,开发了一个简单的经验公式,以调整从RoboColumn®实验数据获得的一阶矩。通过对数据的转换,得到了与台式规模实验数据更加一致的结果。模拟根据调整后的数据对模拟参数进行了评估,证明很适合预测规模放大的台式层析柱的性能。最后,如果在模拟中适当地考虑了馏分收集和多步梯度,估计的参数可成功地建模原始RoboColumn®数据。
详细的理论、材料和方法以及结果讨论,请参考原文。
RoboColumn®实验
采用α-胰凝乳蛋白酶原A或三种单克隆抗体中的一种进行梯度洗脱实验,梯度长度分别为20、40、60、80和100柱体积。在这些实验中,线性梯度用20个连续的步骤变化来逼近 (每个步骤的长度根据总梯度长度在实验之间进行调整)。所有液体流动均通过600 μL(1 CV) 注射进行,使用Tecan FreedomEVO® 150系统,流速为15 CV/hr (4分钟保留时间)。RoboColumns®首先在50mm NaOAC中平衡,pH5.0,3-5 CV。然后将1个CV样品注入层析柱。mAb A、mAb B、mAb C和α-胰蛋白酶原A的样品浓度分别为2.4、1.0、3.0和2.0 mg/mL。梯度从50mM NaOAc, pH 5.0 - 50 mM NaOAc, 500 mM NaCl, pH 5.0运行。96孔板采集200μL馏分。使用Tecan Freedom EVO®150将每个馏分的40 μL样品转移到384孔板上,然后使用读板器进行UV 吸光度 (280 nm、340nm)分析。之后从280 nm的吸光度中减去340 nm的UV吸光度,以提高生成的色谱图的信噪比。
图2. 对于mAb A、mAbB、mAb C和α胰凝乳蛋白酶A,使用从RoboColumn®系统(绿色)获得校正数据和台式系统(红色)上20mL层析柱获得的梯度实验数据评估的参数比较梯度模拟(20、60、100CV),A)POROS®50 HS和B) SP SepharoseFF。
图3. 对于mAb A、mAbB、mAb C和α胰凝乳蛋白酶A,梯度(20、60、100 CV)实验数据(黑色)和使用来自校正数据包的参数的模拟(绿色)的RoboColumn®系统比较,A)POROS®50 HS和B) SP SepharoseFF。
总结
在本文中,通过层析柱模拟进行了一项研究,以评估RoboColumn®和台式系统之间操作差异的影响。这些差异是微型系统局限性的结果,特别是针对洗脱液趋势确定的收集馏分的离线分析(不是传统系统中在线UV传感器的连续信号)以及采用顺序注射的必要性,而不是泵送,以提供液体流动并在RoboColumn®系统中创建梯度。我们首先利用模拟证明馏分收集持续降低了洗脱峰的一阶矩0.17 CV (即这些特定实验中馏分体积的½)。这个馏分体积的1/2的值对任何合理大小的馏分都适用。其次,确定线性梯度的多步梯度近似对一阶矩值的影响取决于步长。
利用这些模拟的结果,开发了一种经验转换方法来校正使用RoboColumn®系统的梯度实验数据所获得的一阶矩。与未校正的RoboColumn®一阶矩相比,校正后的一阶矩与从20 mL层析柱中获得的一阶矩之间的差异降低了约50%。然后,利用校正值估计线性SMA参数,并利用它们成功地预测了规模放大台式系统数据的性能,平均差约为1CV实验保留。最后,当正确模拟多步梯度和馏分收集时,估计的参数被证明非常适合于RoboColumn®数据的建模(在0.5CV实验保留内)。本研究的结果展示了如何利用层析柱模拟来更好地理解高通量机器人平台和传统实验室规模实验之间的观察差异。从模拟中获得的见解可实现定量的(尽管是经验的)校正的开发,其可用于更好地预测大规模实验数据以及对来自RoboColumn®数据的模拟参数的优化评估。考虑到其它操作差异的进一步研究(例如在洗脱过程中暂停液流以补充移液器或由于背压而导致的不完全注入)可能有助于更好地解决机器人液体处理和基于标准层析的柱系统之间的差异。
原文:W.R.Keller, S.T.Evans, G.Ferreira, et al., Understanding the effects of system differences for parameter estimation and scale-up of high throughput chromatographic data. Journal of Chromatography A, 2021, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2021.462696.
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