对抗传染病和肿瘤的病毒样颗粒
本文节选自来自牛津大学的研究人员发表的文章“Virus-likeparticles against infectious disease and cancer: guidance for thenano-architect”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期文章“对抗传染病和肿瘤的病毒样颗粒”。
病毒样颗粒（VLP）可以在传染病和肿瘤的预防和治疗中发挥重要作用。这里，我们将介绍合理构建 VLP 装置的最新进展，以及增强长效抗体和 CD8+ T 细胞反应的新方法。DNA“折纸”和计算蛋白质设计确定了抗原的最佳间距。化学生物学的进步使得用蛋白质或多糖抗原进行简单且不可逆的 VLP 修饰成为可能。马赛克 VLP 共同展示抗原以产生针对不同流感病毒株和冠状病毒的交叉反应性抗体。VLP佐剂作用模式是通过先天免疫刺激的敲除和重新包装建立的。VLP 本身在肿瘤模型中显示出它们作为佐剂的能力。最后，针对疟疾和 SARS-CoV-2 大流行取得了具有里程碑意义的临床结果。
VLP如何提供佐剂效应
单独注射抗原通常不会引起强烈的免疫反应 -激活先天免疫系统很重要。疫苗几乎总是与佐剂一起使用以增加先天刺激。除了VLP 上的多聚体递呈外，其它内部和外部VLP 特征也会影响免疫反应的大小和质量。来自噬菌体衣壳的VLP 会自然地包装来自表达生物体的核酸，从而刺激先天免疫系统。Qβ噬菌体的衣壳蛋白在大肠杆菌中表达并用还原剂解聚，然后将不同的RNA（来自大肠杆菌、HEK 293T或酵母tRNA）包装在里面。VLP 中细菌RNA 的包装在流感模型中诱导了最大的保护作用，改变了抗体同型。这种差异取决于Toll 样受体 (TLR) 7 的先天免疫激活，而不是线粒体抗病毒信号蛋白 (MAVS) 或维甲酸诱导基因 I 样受体(RIG-I)。
TLR 激动剂还可以促进抗肿瘤免疫反应。与新抗原肽相连的小分子TLR7/8a 激动剂可增强不同小鼠肿瘤模型中 CD8+ T 细胞介导的反应。TLR5 和Naip5 炎性体可以被鞭毛蛋白刺激，其是细菌鞭毛的组成部分。鞭毛蛋白附着在基于铁蛋白的纳米笼上增强了Th1 免疫反应。
即使没有抗原载入，VLP 也可以是一种有效的佐剂。静脉注射与光活化药物结合的人乳头瘤病毒-16 VLP。然后用近红外光照射肿瘤以诱导坏死细胞死亡并刺激持久的 CD8+ T 细胞介导的抗肿瘤反应。研究比较了不同 VLP 类型在瘤内注射后的辅助作用。豇豆花叶病毒纳米颗粒的性能优于其它植物、噬菌体或哺乳动物源性纳米颗粒。TLR报告基因分析和敲除小鼠表明，豇豆花叶病毒纳米颗粒可激活TLR2、4 和 7 并促进 I型干扰素的分泌。通过在 VLP 中包装 2',3'-环状GMP-AMP (cGAMP) 显示了招募其它先天免疫元素的价值，这增加了CD4+ 和 CD8+ T 细胞反应并增强了流感保护。
为了增强抗肿瘤功效，VLP 甚至配备了微型“电机”。QβVLP与含有金属镁的 25 μm 颗粒耦合，该颗粒与水反应生成氢气泡并驱动推进。这些用于治疗卵巢癌的“电动装置”被注射到小鼠腹膜中，其中，微电机增加了肿瘤中的 Qβ。
VLP当然可以诱导良好的CD8+ T 细胞反应，但很少达到病毒载体的效力。最近用不同的沙粒病毒载体引发和加强诱导了高达50% 的循环 CD8+ T 细胞池的抗肿瘤反应。
我们注意到，动物研究通常侧重于诱导最强的免疫反应，而没有过多担心炎症副作用。临床转化，至少对于传染病疫苗而言，需要在轻度副作用与强烈诱导特异性免疫反应之间取得平衡。
对免疫系统及其与 VLP 相互作用的基本理解
关于非生物纳米颗粒（例如脂质体、量子点）的定位和生物活性如何依赖于蛋白质冠 -一组与暴露于生物流体的纳米颗粒表面自发结合的蛋白质，已经进行了广泛的研究。蛋白冠也会在病毒上形成并影响病毒感染性（图3b），因此这种表面复杂性是 VLP 工程的一个重要概念。
VLP 糖基化也可能是免疫系统的一个重要特征（图 1）。当颗粒在人细胞系中表达且约 40% 的聚糖是寡甘露糖时，增加乙肝表面抗原 (HBsAg) 上的糖基化可增强免疫原性。甘露糖结合凝集素识别 VLP 上富含寡甘露糖的表面激活补体 C3 的沉积并增强向滤泡树突状细胞的转运，从而促进强烈的免疫反应。基于铁蛋白的纳米颗粒荧光成像表明，表达SIGN-R1（特定细胞间粘附分子-3-捕获非整合素相关 1）的树突细胞群参与了向滤泡树突细胞的VLP 递送。这些颗粒在治疗慢性乙型肝炎病毒的模型中产生了活性。
免疫途径也很重要。为了了解诱导强烈的抗肿瘤CD8+ T 细胞反应的相关性，静脉 VLP 疫苗接种可获得优于皮下接种的反应。在这里，新抗原肽通过与连接到 TLR7/8 激动剂的疏水聚合物偶联而被诱导自组装。T 细胞特异性转录因子 1(TCF1) 被确定为产生的 CD8+ T 细胞的一个重要特征，其维持细胞保持自我更新的干细胞样状态。
优化对 VLP 组装和组成的分析
在纳米技术中，了解已构建的东西通常与构建新结构一样具有挑战性。精确的抗原构象对于诱导保护性抗体至关重要。现在，分离获得蛋白质抗原的高分辨率结构是相对标准的。然而，当抗原附着在纳米颗粒上时，使用结构分析要困难得多。先进的固态核磁共振(NMR) 确定流感血凝素异构体的结构在通过硫醇基交联与 Qβ颗粒偶联后得以保留。AFM现在可以在单分子水平的成核和衣壳形成的可逆性上实现实时可视化。许多人期望蛋白质纳米颗粒的组装完美。然而，冷冻电子显微镜和统计力学模型表明，VLP组装中的错误是正常的，而且难以避免，在乙型肝炎病毒衣壳中有超过15% 的颗粒变形。尽管如此，通过动态光散射和质谱法评估，计算设计的两组分纳米颗粒的组装可以是均匀和完整的。
如何优化 VLP 上展示的抗原
最近的创新提供了应对核心挑战的策略 -如何生产针对不同且不断演变的病原体的疫苗。马赛克纳米颗粒已经可用于多种不同但相关的抗原，其显示在单个颗粒上。结合VLP 上不同抗原之间保守区域的 B 细胞受体应受到最强刺激。因此，马赛克颗粒促进了结合更广泛的病原体菌株的抗体的产生。马赛克纳米颗粒可展示一组多达8个不同的沙贝病毒受体结合域 (RBD) (图4a)。这些 VLP 对颗粒上未展示的进化相关病毒产生了良好的反应，表明有可能对抗新的 SARS-CoV-2 变异株和新出现的人畜共患冠状病毒。马赛克纳米颗粒也已被开发用于更广泛地中和流感反应，通过基因融合或异肽偶联展示不同的血凝素三聚体。
图4. 针对冠状病毒和疟疾的 VLP 装置。(a)用于广泛冠状病毒保护的马赛克疫苗。来自SARS-CoV-2 或其它沙贝病毒的 RBD 异构体带有SpyTag表达，允许与SpyCatcher003-mi3 纳米颗粒共价偶联。在同一VLP 上展示不同的 RBD 会引发对沙贝病毒具有广泛反应性的抗体。(b) 两组分 SARS-CoV-2 VLP 疫苗。融合到三聚体I53-50A 组分（灰色）和五聚体 I53-50B 组分（橙色）的 SARS-CoV-2 RBD（浅蓝色）模型。这些成分分开表达，然后混合，以产生带有60 个 RBD 拷贝的纳米颗粒，用于免疫。(c) 疟疾VLP 疫苗试验结果。在第三次疫苗接种后随时间绘制疟疾发病率。第 1组：5 μg R21/25 μg Matrix M。第 2组：5 μg R21/50 μg Matrix M。第 3组，狂犬病对照疫苗接种。显示 R21 融合蛋白的组织结构。
使用称为纳米图案（nanopatterning）的创新策略，可对抗原进行修饰，以聚焦抗体反应。寨卡是一个特别困难的疫苗靶标，因为非中和抗体会导致抗体依赖性增强(ADE)，从而增加病毒进入细胞的速度。非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸引入到寨卡病毒囊膜糖蛋白结构域 III 的特定位点，可允许偶联到 PEG。当在VLP 上展示时，抗体反应的目标是远离聚乙二醇化区域，以促进有效的寨卡中和抗体的诱导。
VLP 的重要临床结果
首批获批的针对 SARS-CoV-2 的疫苗是腺病毒载体、mRNA 疫苗以及灭活的SARS-CoV-2。已经针对 COVID-19 疫苗测试了大量的纳米颗粒策略，因为 VLP 可有效诱导中和抗体，并且可能在稳定性和可放大性方面具有优势。Novavax 的 NVX-CoV2373 是一种合成脂质纳米颗粒，展示SARS-CoV-2 刺突，以融合前构象稳定，并已成功完成III 期试验。另一种脂质纳米颗粒候选产品采用CoPoP 耦合，正在进行 I/II 期（试验 ID：NCT04783311）。
基因融合至VLP针对 COVID-19 产生了有希望的结果。铁蛋白上的稳定刺突正在进行 I期（试验ID：NCT04784767）。RBD 与I53-50A 融合并与 I53-50B 混合，组装成双组分纳米颗粒（图 4b），该纳米颗粒已进入 I/II 期（试验ID：NCT04742738）。COVID-19 候选疫苗已使用标签/捕集体连接开发，与蛋白质纳米颗粒 mi3、AP205（试验ID：NCT04839146）或 HBsAg （试验ID：ACTRN12620000817943）偶联。此外，从本氏烟草的细胞内膜出芽的、展示刺突三聚体的 VLP 已进入 II/III 期（试验ID：NCT04636697）。
针对疟疾，VLP 的合理设计已取得重大进展。R21 是恶性疟原虫环子孢子蛋白的一部分和HBsAg 之间的基因融合，辅以 Matrix-M（图 4c）。IIb 期试验证明了良好的安全性和 1 年后具有里程碑意义的 77% 的疗效（图4c）。III 期试验现在正在更长的时间内测试更大的人群（试验 ID：NCT04704830）。对NANP重复的抗体反应与疫苗效力相关。R21/Matrix-M 先前显示可诱导大量 CD4+ T 细胞，但CD8+ T 细胞对环子孢子蛋白的反应非常低。R21/Matrix-M 对 HBsAg 支架（将对乙型肝炎病毒提供一些保护）的抗体反应非常低。与需要感染细胞的病毒载体不同，对VLP 上展示的抗原的免疫反应不会被预先存在的针对VLP 支架的抗体阻断。
总结
现在的进展使得在 VLP 上排列复杂抗原成为常规，其可用于临床开发并诱导针对传染病疫苗接种的保护性抗体反应。现在正在积累数据，以比较特定 VLP 特征对临床前模型中免疫反应的影响。针对SARS-CoV-2 的多项试验将有助于揭示 VLP 特征如何影响人体免疫力。持续性传染病和肿瘤提供了最具挑战性的目标，正是在这里，测试新的 VLP 设计可能会获得最大的收益。
原文：R.A.Hills, M.Howarth, Virus-like particles against infectious disease and cancer: guidance for thenano-architect. Current Opinion in Biotechnology, 2022, 73: 346-354.
相关阅读