增强LNP-mRNA的效力和安全性 - I
本文节选自来自BioNTech的研究人员Irena Vlatkovic发表的文章《Non-Immunotherapy Application of LNP-mRNA: Maximizing Efficacy and Safety》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
LNP-mRNA候选药物中mRNA和LNP成分的创新及其生产方法的改进是这一相对年轻的治疗领域的标志。这种不断的发展是LNP-mRNA的巨大治疗潜力和预期增长的基础，不仅针对疫苗和免疫治疗，而且也针对更具挑战性的应用，如RNA蛋白替代和单克隆抗体治疗。mRNA水平的创新包括(1)RNA核苷修饰、(2)序列和结构优化、(3)IVT mRNA的生产和纯化方法(图3)。
图3. 提高LNP-mRNA的有效性和安全性的策略。(a) mRNA优化包括(1)使用不同的mRNA核苷修饰；(2)通过改变帽结构和/或利用抗反向帽类似物(ARCA)增加mRNA的加帽；(3)选择最有效的UTR：通过避免或利用微(mi)RNA、长非编码(lnc)RNA和RNA结合蛋白(RBP)识别的调控基序，优化5’和3’ UTR；(4)通过使用更频繁的密码子，避免特定的基序，改变G:C含量，优化编码序列(CDS)；(5)通过改变体外转录(IVT)反应的成分和条件来减少副产物，提高产量，并开发适合不同应用的最佳纯化方案。(b)脂质纳米颗粒(LNP)优化可能包括(1)改变LNP组分之间的化学性质和摩尔比，重点关注可电离脂质和隐形脂质的生物可降解性和新颖性；(2)主动靶向其它组织，如使用可识别T细胞、淋巴细胞和脑或肺血管上的特定分子的单克隆抗体（mAb）。(c)此外，为了获得更高的疗效和最大的安全性，可能可以使用与LNP-mRNA候选药物共制剂的分子，如糖皮质激素(地塞米松)或其它已知可抑制先天免疫的小分子。优化作为组分的mRNA和LNP，并将LNP-mRNA与免疫抑制剂结合，旨在提高LNP-mRNA候选药物的安全性和有效性。
mRNA核苷修饰
mRNA核苷修饰是一个关键的发现，增强了mRNA的有效性和安全性。Karikó等人在2005年发现，核苷修饰的RNA与未修饰的mRNA相比，其免疫原性要低得多。研究表明，与未修饰RNA相比，修饰核苷5-甲基胞嘧啶(m5C)、6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基尿苷(m5U)、2-硫脲嘧啶(s2U)或伪脲嘧啶(Y)的加入显著减少了人树突状细胞(DC)分泌细胞因子。增加单位mRNA修饰核苷的含量与DC中TNFα表达的相对抑制成正比。2008年，Karikó等人进行了小鼠体内研究，发现RNA修饰不仅提高了安全性，而且提高了翻译能力和mRNA的稳定性。Andries等人检测了体外和小鼠体内的翻译和免疫原性，发现加入1-甲基伪尿嘧啶(m1Ψ)的mRNA优于加入Ψ的mRNA。由于m1Ψ能够显著降低输液反应的可能性并提高疗效，今天，m1Ψ已成为各种LNP-mRNA应用中最常用的RNA修饰，包括疫苗、治疗性抗体或RNA蛋白替代。例如，BioNTech/辉瑞和Moderna的COVID-19疫苗都利用了m1Ψ修饰的mRNA。
mRNA序列和结构优化
mRNA序列和结构优化包括一系列已知的策略，用于提高LNP-mRNA治疗药物的药理学和安全性。优化帽结构、5’和3’UTR、编码序列和poly(A)尾长度可能会显著影响LNP-mRNA治疗的性能(图3)。通过5'-5'三磷酸桥将7-甲基鸟苷(m7G)帽与合成的mRNA有效连接，形成m7GpppN结构是高效翻译的必要条件。在细胞质中，eIF4E翻译起始因子与帽结合，允许mRNA开始翻译。帽与poly(A)尾和RNA结合蛋白一起，对mRNA的循环至关重要，确保全长翻译和翻译增强。此外，在细胞质中，帽与mRNA脱帽机制结合，从而影响mRNA降解。之前已经讨论过，cap0，而不是cap1，通过RIG-I和MDA5诱导细胞因子，而IFIT1可以与cap0结合，但与cap1或cap2的亲和性明显较低。因此，我们预计，在某些细胞类型中，cap1的甲基化也可以提高翻译效率。在过去的20年里，为了提高IVTmRNA的效率和安全性，人们开发了多种不同的合成帽结构。帽可以使用牛痘加帽酶酶加到mRNA5’端，就像最近在Moderna的COVID-19疫苗mRNA-1273中使用的那样。或者，在IVT反应过程中，通过一种称为共转录加帽的过程进行加帽，如BioNTech/辉瑞COVID-19疫苗BNT162b2。最近，允许共转录加帽的多种类型的三核苷酸cap1类似物已经上市。CleanCap Cap1 AG三聚体和抗反向帽类似物 (ARCA) CleanCap1已被广泛使用。
mRNA的另一个重要结构特征是位于mRNA5’端和3’端的非翻译区域(5’ UTR和3’UTR)，定义了mRNA的稳定性、定位和表达。它们的序列中存在被microRNA (miRNAs)、长ncRNA (lncRNA)或RNA结合蛋白(RBP)识别的顺式调控元件，这会影响翻译并决定mRNA的命运。Jain等人将miRNA目标位点引入治疗性mRNA的UTR中以招募内源性miRNA，从而减少mRNA的脱靶表达。在他们的研究中，将肝细胞特异性miR-122目标位点的多个拷贝引入编码凋亡蛋白的mRNA的3’ UTR中，阻止了健康肝细胞中mRNA的表达，同时允许肝癌细胞中的选择性凋亡。利用细胞lncRNA和RBP进行mRNA治疗的转录后调节仍处于起步阶段，未来肯定会是一个有趣的创新领域。当设计最佳的5’UTR结构以延长LNP-mRNA表达时，应避免使用发卡、假结、RNA G-四重体、上游开放阅读框(uORF)和上游起始密码子(uAUG)等全面抑制翻译的5’UTR结构。
治疗性mRNA中使用最广泛的5’和3’UTR来自含元件的α-和β-珠蛋白mRNA，其可以增加mRNA的翻译和稳定性。多项研究筛选了适用于多种应用的最佳UTR。例如，Asrani等人发现5’UTR作为蛋白表达的关键驱动因素，且在针对十个5’ UTR的筛选中，相比对照UTR，在体外人体细胞中，补体因子3(C3)和细胞色素p4502E1(CYP2E1) 5’ UTR展示了最大和最一致的蛋白质表达增加。Sample等人最近建立了一个包含280,000个随机50mer 5’ UTR的库，他们将其与多肽分析和深度学习相结合。随后，他们利用这一方法建立了一个模型，并设计了新的5’UTR，可以指导核糖体载入并实现最佳翻译。Orlandinivon Niessen等人最近利用一种无偏的体外方法筛选了3’UTR基序，其中基序与mRNA的稳定活性和促进高翻译活性相关联。该研究发现，在不同的系统中，包括在静脉注射gp70编码mRNA后的小鼠中，使用基于线粒体编码12SrRNA (mtRNR1)的氨基末端增强子(AES) 3’UTR元件，与之前使用的两个头尾克隆的人β-球蛋白3’UTR(2hBg)相比，是有益的。这些3’UTR元件最近被用于BioNTech/辉瑞的COVID-19疫苗。
通过用频繁使用的同义密码子替换罕见的密码子，增加G:C含量，并避免某些调节序列来构建最佳编码序列，从而整体提高mRNA蛋白表达。然而，不同的密码子优化必须根据治疗性mRNA的应用和特定的目标细胞类型进行经验测试。Poly(A)尾和帽对翻译和mRNA稳定性有影响。Poly(A)尾可以在质粒DNA模板中定义，并在IVT反应中转录，以保证Poly(A)尾的长度均匀，或者，mRNA可以在IVT后通过重组Poly(A)聚合酶延长。这两种方法都有局限性：在克隆编码长Poly(A)尾的质粒时存在技术困难，或者在酶聚腺苷酸化的情况下，在生产过程中确保一致的Poly(A)尾长度和产物均一性也具有不小的挑战。今天，大多数治疗性mRNA Poly(A)尾巴的长度至少为50nt至≥100nt。根据各种全基因组Poly(A)尾分析方法，这些长度反映了大多数内源性mRNA的平均长度，这也显示，大多数mRNA尾明显比先前认为的250个腺苷的尾长度要短。
原文：I.Vlatkovic,Non-Immunotherapy Application of LNP-mRNA: Maximizing Efficacy and Safety.Biomedicines, 2021, https://doi.org/10.3390/biomedicines9050530.
相关阅读：