如何克服高剂量AAV的“毒性”：新一代载体可以挽救局面
本文节选在来自Roche的Julia Fakhiri博士和来自德国海德堡大学的Jihad El Andari博士发表的评论文章《The dose makes the poison: next generation AAV vectors can save the day》。由于水平有限，详细内容，请参考原文。
用于基因治疗的AAV载体简介
考古遗迹为我们提供了确凿的证据，证明人类在漫长的进化过程中利用自然资源来生存并获得更多“福利”。医学应用的例子也有很多 - 从发现青霉素(一种霉菌提取物)的抗菌特性，到采用减毒病毒或最近的病毒载体进行疫苗接种。20世纪60年代最不引人注目的发现之一，或许就是在另一种病毒样品 (腺相关病毒命名来源的腺病毒) 中检测到作为污染物的腺相关病毒(AAV)。从那时起，经过50年的研究，AAV已经被成功地用于治疗性基因递送的工具。这种特殊的病毒载体系统的流行归功于多种特性，例如：
没有任何已知的致病性
病毒基因组结构简单，可以用目的转基因取代所有的病毒基因
在过去的几年中，一些基于AAV的疗法已经成功地进入了欧美医药市场，被认为是现今将对现代医学图景产生重大影响的新兴药物。21世纪基因组医学的复苏始于重组AAV1载体Glybera®，该产品于2012年获得批准，用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症，只需一次注射。2017年和2019年监管机构又分别批准了Luxturna™ (rAAV2)和Zolgensma® (rAAV9)。虽然这些疗法最近几年才获得批准，但许多与自然AAV血清型不同的下一代载体已经在排队等候。有些类型刚刚在起跑线上，而其它一些类型正在接近终点线。
AAV载体的当前局限性和经验教训
目前仍有许多挑战阻碍着rAAV介导的基因治疗的最佳应用。其中，AAV的包装容量受限(~4.7 Kb)以及缺乏固有的器官特异性是我们主要关注的问题。以AAV9为例，当静脉给药给非人类灵长类动物(NHP)时，显示器官范围的分布以及在中枢神经系统内的低积聚，而脑池内给药则会导致大脑和脊髓的转导。换句话说，根据需要基因矫正的特定组织或器官，给药途径是一个需要考虑的重要方面。而剂量评估又为此增加了另一层面的复杂性，以实现高效和安全的载体递送。迄今为止，尽管基因治疗领域的知名专家对安全性提出了很大的担忧，但为了在系统性给药后达到治疗效力，通常需要≥1× 10^14个基因组拷贝/kg (gc/kg)的高剂量。不幸的是，在大型动物模型和一些临床试验中已经报道了严重的毒性作用，这通常与肝酶升高和肝损伤有关。例如，在注射了衣壳包裹SMN以用于治疗脊髓型肌萎缩症（SMA）的2 × 10^14 gc/kg AAV9异构体 (AAVhu68) 的猕猴中观察到严重的肝毒性。然而，目前尚不清楚全身毒性是否总是或主要是由于肝细胞损伤所致。在Solid Biosciences和Pfizer使用近似剂量治疗Duchene肌萎缩症(DMD)的试验中，并发症主要是免疫反应(即补体激活和炎症)的结果。此外，在Zolgensma®的临床研究中，报告了心肌肌钙蛋白-I水平的短暂升高，尽管主要的不良反应(发生率≥5%)表现为呕吐和肝转氨酶升高。值得注意的是，在SMA的动物研究中也观察到了心脏毒性。
最近报道的最严重的副作用（SAE）之一是Audentes (安斯泰来子公司)在一项X-连锁肌管肌病(MTM)基因治疗临床试验中报道的案例。表达MTM1基因的AAV8高剂量给药最终导致三名研究参与者悲剧性的死亡。尽管2例最终死于败血症，1例死于消化道出血，但所有3例受试者都经历了严重的肝毒性。而在低剂量(1 × 10^14 gc/kg)组中未观察到这些严重的副作用。在另一项由Adverum Biotechnologies进行的临床试验中，AAV2.7m8衣壳通过玻璃体内注射进入眼睛。尽管利用了局部给药途径和眼部免疫特性，但在高剂量组(6 × 10^11 gc/眼)中有1例患者最近发生了治疗眼的低眼压和视力丧失。总结来看，无论在临床研究中是什么引起了不良影响 (即肝毒性或免疫反应)，都必须进行彻底的调查，并清楚地认识到，应该仔细重新考虑给药的高剂量。
最后，我们认为有必要开发更有效的载体，即使用低剂量就足以显示治疗效益，同时又不让病毒颗粒“压倒”宿主系统。这不仅从临床的角度来看很重要，而且从生产的角度来看，在减少临床规模载体生产的资金投入和劳动力负担方面，也很重要。
下一代AAV载体：更好的安全性，而不是“遗憾”
对于影响多个器官或组织的遗传疾病，找到合适的应用途径变得更加关键。涉及不同肌肉类型的遗传性肌肉疾病显然属于这一类型。DMD就是一个例子，这是一种“毁灭性”的疾病，全球发病率为每10万名男性中有7.1例。在这种疾病中，肌萎缩蛋白基因的突变导致肌肉逐渐丧失，最终影响多个器官，如骨骼肌、隔膜和心脏。因此，为了获得有效的基因治疗，系统性给药途径似乎更合理。事实上，使用效率低且非特异性的载体将需要大剂量才能实现治疗效益，从而增加了发生临床并发症的可能性。
rAAV技术进化的时间线：图中所示为AAV基因治疗历史上的不同转折点，从AAV 2血清型的分离和克隆开始，到应用机器学习方法预测新的AAV异构体。第一代AAV载体是通过DNA家族重组或肽段显示技术创造的，而第二代AAV载体为标签或基因融合到纳米体或DARPins。
rAAV技术进化的时间线：图中所示为AAV基因治疗历史上的不同转折点，从AAV2血清型的分离和克隆开始，到应用机器学习方法预测新的AAV异构体。第一代AAV载体是通过DNA家族重组或肽段显示技术创造的，而第二代AAV载体为标签或基因融合到纳米体或DARPins。
幸运的是，已经出现了一些技术来制备具有优化特性的第二代和第三代AAV病毒载体(上图
）。通常，这些方法要么通过衣壳工程而聚焦于改造载体的外壳，要么通过使用组织特异性启动子和调控元件而聚焦于包装的治疗性基因盒。病毒衣壳是递送的第一线，因为它定义了病毒的趋向性，即载体所靶向的器官、组织甚至细胞的类型。有两种主要的方法可以产生新的AAV衣壳，这些衣壳将具有独特的基因治疗“资产”：
随机、高通量技术；和
合理设计
第一种方法依赖于选择的力量，会产生大规模的AAV衣壳文库，在选择一种特定的给药方法后，其循环通过目的组织。其中，用于衣壳多样化的最流行的分子技术是DNA家族重组、肽展示和易错PCR(或几种方法的组合)。其目的是在靶组织中富集病毒基因组，从而使衣壳的性能不局限于亲代血清型的特性(通过定向进化)。这种“正向”选择方法也可以与并行的“反向”选择相结合 (即脱靶器官或易受预先存在的中和抗体影响的异构体从文库删除)。这些方法的应用已被证明是成功的，并产生了许多具有增强特性的衣壳，如AAVDJ，由AAV血清型2、8和9组成的嵌合AAV，对小鼠肝脏具有特异性以及免疫逃避能力。最近的例子还包括AAV2.7m8、AAV2.GL和AAV2.NN，它们都是AAV2衍生的异构体，在眼睛中具有优越的转导能力，此外，还有PHP.B和AAVMYO，它们在大脑和肌肉中比它们的亲代AAV9更有效率。最后，我们想强调在硅（计算机）祖代重建的方法，而不是通过进化来重建祖代AAV（现存AAV序列的亲本）。这些重组序列不仅有助于了解AAV的进化历史，而且为定向进化提供了序列信息，从而找到多种有前景的AAV载体。一个有趣的例子是Anc80L65，它在NHP的内耳中表现出了很高的效率。无论采用何种方法，预测一种特定的衣壳在不同物种之间或最终在人类体内的表现仍然是非常具有挑战性的。
相比之下，合理设计方法是相对耗时的，因为它们需要构建和评估每个构建块。在AAV衣壳上植入纳米体或DARPins，或者由不同病毒元素组成的杂交载体就是一个例子。此外，机器学习目前是一项非常有吸引力的技术，由Church Lab最近率先开发的AAV衣壳设计技术具有巨大的潜力。这种不断进化的方法可能使科学家最终能够从零开始“裁剪”出高特异性、高效的病毒衣壳，并可能最终为我们提供关于工程衣壳在人体中转化的答案。最后，单细胞RNA测序技术已经开始提供更全面的AAV“命运”特征，并被应用于新的、更特异的AAV候选产品的鉴定。
事实上，我们坚信，从上述所有技术(和其它技术)中涌现出来的新型合成载体将重塑基因治疗的未来，并将应用范围扩大到以前未曾预料到的领域。
AAV介导的基因治疗不再仅仅基于基因替代
经过近50年的研究和无数的“陷阱”和成就，基因治疗终于从一个看似未来的想法成长为上个世纪最大的成功故事之一。生物医学领域的快速创新正在不断重塑我们对基因治疗的理解。在70年代早期，Theodore Friedmann和Richard Roblin设想基因治疗是用一个功能性拷贝来替换一个有缺陷的基因。虽然目前基因治疗市场上的一些产品仍然基于突变基因的替代，但科学家们正在不断开发更强大的分子工具和递送平台，这可能会扩大可以挽救的遗传疾病的范围。这里，DNA编辑技术已经展示了其巨大的潜力，包括锌指核酸酶、TALEN和/或CRISPR/Cas9(包括其所有新出现的衍生版本)，这些技术允许破坏、修复或替换患者的DNA序列。Sangamo Therapeutics进行了首个应用编辑技术(锌指核酸酶)的临床试验，用于治疗一种称为粘多糖症II型的遗传代谢疾病。此外，Editas Medicine和Allergan最近推出了首个CRISPR疗法，以纠正一个点突变，作为治疗莱伯氏先天性黑内障(LCA)的潜在疗法。除了DNA编辑工具之外，调控分子，如小非编码RNA，目前也被用于“利用”内源性机制，要么使用微-/shRNA沉默基因表达，要么通过使用长反义引导RNA以招募作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)，来修饰突变RNA中的单碱基突变。目前，上述所有技术都与AAV相结合，并在安全性和效力方面进行了研究。例如，基因编辑技术的一个严重问题是，在引入双链断裂后，AAV载体在多个器官中高水平整合。使用更强大和更具针对性的载体优化递送是提高整体编辑效率和精度的一种方法。相应的，这些载体理论上可以限制在不受影响的组织甚至细胞中基因组的非预期整合，从而限制种系传递或任何脱靶器官中的潜在毒性。
总的来说，我们相信我们正在见证基因组医学的一个转折点。新兴的高通量技术正在加速功能基因组学的发展，从而不断扩大我们对人类基因组及其复杂疾病病理的理解。很明显，不会出现“赢者通吃”的情况，但上述新技术的结合将促进未来在治疗遗传性疾病方面取得更大的成功。现在比以往任何时候都更需要新一代载体，以赶上技术发展的更快步伐。
原文：J.Fakhiri, J.E.Andari, The dose makes the poison: next generation AAV vectors can save theday. Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(6), 717–722.
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