Cell|生酮饮食对肠道菌群的影响

    诺米今天为大家分享一篇2020年发表在Cell（影响因子38.637）题为Ketogenic Diet Alter the Gut Microbiome Resulting in Decreased Intestinal Th17 Cells的文章，文章研究了肠道和肝脏生酮对肠道微生物组的影响并为肠道上皮细胞中酮体产生的生理作用提供理论支持。

文章题目

Ketogenic Diet Alter the Gut Microbiome Resulting in Decreased Intestinal Th17 Cells

发表期刊

Cell

（IF=38.637）

发表时间：2020

引言

    生酮饮食(KDs)是指饮食中富含较高含量的脂肪，较低含量的碳水化合物。生酮饮食可以有效加快代谢，提高酮体代谢。文章主要表明KDs改变人类和小鼠肠道菌群的方式不同于高脂肪饮食(HFDs)。一项为期8周的住院患者粪便样本的宏基因组和代谢组学分析显示，KD治疗期间肠道微生物群落结构和功能发生了显著变化。小鼠梯度饮食实验证实了KDs不同于HFDs，体外和体内实验表明，酮体有选择性地抑制双歧杆菌生长。最后，对无菌小鼠进行单菌定殖和人类微生物组移植后发现，KD相关的肠道微生物组降低了肠道促炎Th17细胞的水平。文章结果强调了宿主和微生物细胞之间的重要性，以及饮食和宿主生理之间的机制联系。

Highlights

1. 生酮饮食(KDs)改变肠道微生物群的方式不同于高脂肪饮食

2. 肠道微生物在KDs上的变化部分是通过宿主产生酮体来驱动的

3. β-羟基丁酸选择性抑制双歧杆菌生长

4. KDs相关的肠道微生物群降低了肠道Th17细胞水平

研究背景

    生酮饮食(KDs)可应用于多种疾病治疗，但其代谢过程与免疫结果有待研究。肠道菌群对饮食摄入高度敏感，在协调宿主代谢和免疫中发挥核心作用，所以研究推测KDs可能通过肠道微生物群发挥疗效。文章通过结合控制性饮食干预和后续小鼠实验研究来观察KDs是否改变肠道细菌丰度机制。

研究结果

1. 生酮饮食可改变人类肠道菌群

    对17名成年超重或I类肥胖非糖尿病男性进行了一项住院交叉研究。参与者首先被喂食 4周基线饮食(BD)(50% CHO，15%蛋白质，35%脂肪），随后是4周的KD (5% CHO，15%蛋白质，80%脂肪)(图1A)，导致肌体循环血浆升高(图1B)。受试者在两次收集粪便期间均处于相似的轻度负能量平衡状态。16S rRNA基因测序显示，两种饮食之间的肠道菌群发生了显著变化(图1C和S1A)，包括放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度的变化(图1D)。19个属差异显著，而双歧杆菌的KD下降幅度最大(图1E)。宏基因组测序表明，双歧杆菌细菌种类减少(图2A和2B)。通过质子核磁共振对粪便代谢组进行分析，发现BD期和KD期粪便代谢谱显著分离(图1F和S1B)。两个饮食组在短链脂肪酸水平(图1G)或细菌负荷(图1H)上并没有差异。图1图2图S12.生酮饮食改变肠道微生物群的方式不同于高脂肪饮食
    高脂饮食(HFDs)以牺牲拟杆菌门(Bacteroidetes)为代价，使厚壁菌门(Firmicutes)增加，而KDs的作用正好相反。为了解决这个差异，给C57BL/6J小鼠喂食3种匹配的饮食3周(图3A)：低脂饮食(LFD, 78/12/10 CHO/脂肪/蛋白质)，高脂饮食(15/75/10)和KD(0/90/10)。与其他饮食相比，KD提高了血浆中β-羟基丁酸酮体(βHB)的含量(图3B)。与喂食饲料或LFD的小鼠相比，高脂膳食和KD摄入的小鼠可获得更多的卡路里(图3C)体重增加也更明显(图3D)。    16S-seq结果显示，饲粮对肠道菌群有显著影响(图3E)。HFD增加了厚壁菌门的相对丰度。KD趋势与之相反(图3F)。KD也降低了放线菌的相对丰度(图3F)。通过比较HFD和KD，发现了10个差异丰富的属(图3G)，其中双歧杆菌数量最多KD下降幅度最大。总定殖率在两种不同的饮食中具有可比性(图3H)。经过10周的饮食干预，和长达11个月的时间喂养，小鼠肠道微生物的变化是稳定的(图S2A-S2C)。与低脂饮食相比，高脂饮食和KD饮食组的卡路里摄入量、体重和脂肪含量均显著升高(图S2D-S2F)。与HFD组相比，KD组小鼠增重显著减少(图S2E)，尽管性腺脂肪或肝脏重量没有显著差异(图S2F和S2G)。    用富含植物多糖的另一种CHO来源重复上述研究(图S3A)。小鼠按降低日粮CHO的顺序依次饲喂3天。在Chow-LFD和HFD-KD转变后的一天内，肠道微生物群发生了变化(图S3B)。拟杆菌门(Bacteroidetes)在CHO酶切作用下减少，厚壁菌门(Firmicutes)相应增加(图S3C)。放线菌对CHO的响应呈非线性，此结果与为期3周的饮食干预一致，饮食和肠道微生物群之间的非线性关系表明，可能存在一个临界点，微生物群对宏量营养素摄入的反应不同。图3图S2图S3    为了更准确地确定这个临界点，在原来高脂饮食中测试了含有CHO水平的饮食(图4A)（HFD75；15%CHO）和KD（0%CHO），HFD85（5/85/10 CHO/脂肪/蛋白质)和HFD89 (1/89/10)循环酮体水平。随着饮食CHO的降低而增加(图4B)，在热量摄取量、体重或肥胖程度上没有显著差异(图4C-4E)。HFD75/HFD85和KD之间的肠道菌群显著改变，但HFD89和KD之间没有改变(图4F)。与HFD75相比，三种饲料中拟杆菌门都有所增加，放线菌随着CHO的减少而逐渐减少(图4G)。我们在HFD89和KD之间检测到两个差异丰富的属(图4H)。双歧杆菌随着CHO的减少呈递减趋势(图4H)，反映了放线菌门的整体情况(图4G)。乳杆菌在KD上显著减少(图4H)，而厚壁菌门总体上没有变化(图4G)。这些结果表明，尽管CHO持续摄入，但部分的生酮诱导足以改变肠道菌群。图43.酮体直接抑制肠道细菌的生长    多种机制可能导致HFD和KD之间的肠道菌群差异。先前的研究表明，饲喂多糖缺乏饲料的小鼠粘液觅食增加；本研究表明即使没有膳食CHO也能维持黏液层(图S4A-S4C)，而缺乏主要结肠黏液蛋白的Muc2缺陷小鼠在KD上仍表现出类似的肠道菌群变化(图S4D-S4F)。文章重点研究了在CHO限制反应中表明脂质氧化增加的酮体。肝脏是主要的生酮器官，肠上皮细胞也能够产生酮体，肠组织中βHB在KD上也增加。    为了研究在没有CHO限制的情况下，酮体对肠道菌群的影响，在HFD中添加合成酮酯(KE)(图5A)，模拟肠道βHB的产生。在两个独立实验中，添加KE显著提高了高脂膳食中βHB的循环水平，低于KD的摄入水平(图5B)。饲粮中添加KE或KD均显著提高了肠道βHB浓度(图5C)。肠道组织中βHB升高(图5D)。各组的卡路里摄入量相似(图5E)；然而，喂食KEs的小鼠体重明显增加较少(图5F)。与高脂对照组相比，高脂喂养的小鼠也显著减少了肥胖(图5G)。16S-seq结果显示，补充KE显著改变了高脂饲料的肠道菌群(图5H)。3个属在饮食和药物诱导的酮症反应中一致发生改变(图5I)。其中，只有双歧杆菌与肠腔内βHB显著负相关(图5J)，人和小鼠体内KD的丰度也降低(图1E和3G)。    βHB对人类肠道菌群也有类似的影响。将4名人类捐赠者的粪便样本与三种不同浓度的βHB(12.5、25和50 mM)的BD或对照物进行孵育。βHB以剂量依赖性的方式抑制了体外菌群的生长(图5K)，而16S-seq显示，在βHB为50 mM时，没有明显的生长(图5K)，但微生物群落的广泛变化在门水平上很明显(图5L)。研究发现与50 mM βHB相比，放线菌的丰度显著降低，拟杆菌的丰度增加。在βHB存在的情况下，体外菌群中共有12个属发生了显著改变，包括双歧杆菌和乳酸菌的丰度降低(图5M)。这些结果与体内的发现一致，观察到喂食酮酯的小鼠肠道菌群中这两种菌群的选择性限制，并将研究发现扩展到人类肠道菌群。图S4图5    βHB直接限制双歧杆菌的体外生长。从人类粪便样本中分离出一株双歧杆菌(菌株BD1)，这是人类队列中差异最丰富的双歧杆菌品种(图2A)。βHB以剂量依赖的方式抑制BD1的体外生长(图S6A)，并在最高浓度测试时具有抑菌作用(图S6B)。丁酸盐是一种短链脂肪酸，化学性质与βHB相似，具有类似的生长抑制作用(图S6C)。中和的βHB在添加到生长培养基之前，丁酸盐消除了它们的生长抑制作用(图S6A和S6C)。在已知βHB浓度下，将培养基酸化以匹配培养基的pH值，这表明βHB通过pH依赖机制抑制了B. adolescent的体外生长(图S6D)。对大多数分离株来说，抑制R90%生长所需的浓度(MIC90)在25 ~ 50 mM之间，但Egger属thella和乳酸菌中的分离株在最高浓度时对βHB的生长抑制不敏感。βHB对部分细菌的促生长作用(图S6E)与体内研究(图5I)和体外研究(图5M)相反，没有检测到βHB对双歧杆菌的选择性作用。相对于其他门，拟杆菌门对βHB的生长抑制更敏感(图S6F)，而在人类(图1D)、小鼠(图3F和4G)和体外孵育期间观察到的拟杆菌门相对丰度增加(图5L)。从而在体内观察到βHB对双歧杆菌的靶向特异性可能受物种间相互作用或环境的驱动影响。数据表明，饲喂生酮饲粮的小鼠盲肠大部分内容物中的βHB浓度为5 nmol/g(图5C)，这比体外试验测试的浓度(12.5-50 mM)低了几个数量级。而肠道组织中βHB的浓度大约比管腔内容物高三个数量级(图5D)，这可能表明在肠上皮附近的细菌可能暴露于相对较高的βHB局部浓度，类似于体外测试的浓度。在复杂的微生物群落和胃肠道生理背景下，βHB对双歧杆菌的作用机制有待进一步研究。图S64.宿主生理病理研究    人类肠道双歧杆菌包括B. adolescent，在单定殖小鼠中诱导促炎症肠道Th17细胞。在整个实验过程中，用B. adolescent单菌定植小鼠后，导致小鼠小肠(非大小肠)中CD4+白细胞介素(IL)-17a+ (Th17)细胞显著增加(图6A和S7A)，摄入一种KD阻止了小鼠小肠Th17细胞的诱导B. adolescent(图6B)，与HFD喂养的小鼠相比，B. adolescent在回肠的定植显著减少(图6C)。肠道中的CD4+干扰素(IFN)Y+ (Th1)细胞水平不受B. adolescent单定殖两种饮食的影响(图6D和6E)，这与之前的报道一致，表明B. adolescent优先诱导小肠中的Th17细胞。这些数据表明，部分由于宿主产生的酮体(图6F)，KD通过降低定殖水平来介导小鼠肠道Th17细胞。    之后研究在人类肠道菌群环境下双歧杆菌相对丰度的变化是否会转化为肠道Th17细胞积累。将BD或KD期收集的人类供体粪便菌群接种无菌小鼠，并在缺乏双歧杆菌的KD菌群中添加B. adolescent BD1 (KD+BA)。粪便样品的16S-seq显示，BD和KD两种微生物群之间建立了不同的微生物群落(图6I)。KD组的双歧杆菌丰度显著低于BD组或KD+BA组(图6J)。与在移植后第12天检测到的BD组或KD+BA组相比，接受KD菌群的小鼠显示出明显较低的肠道Th17频率(图6K)。Th1细胞数量无显著差异(图6L)。这些结果表明，在复杂的人体肠道微生物群落中，双歧杆菌的丰度变化对肠道Th17的积累有显著影响。    鉴于BD与KD相关菌群的人类粪便移植足以揭示肠道中Th17细胞积累的差异，假设在常规小鼠饮食实验中也可以检测到肠道中Th17频率的差异。与这一假设相一致的是，喂食KD的常规小鼠小肠Th17细胞(SI)水平低于喂食HFD的小鼠(图7A和7D)。同样地，小鼠被喂食含KE的HFD。降低了肠道菌群中双歧杆菌相对于HFD的丰度(图51)，导致小肠Th17细胞积累减少(图7A)。大肠(图7B)和脾脏(图7C)的Th17细胞水平无显著差异。肠道和脾脏中其他免疫细胞群的免疫表型(图S7B)与HFD相比，未显示出一致的变化。SI - Th17细胞积累也存在差异，膳食CHO摄取量有微小变化(图7D)。与相似的高脂低CHO饲粮相比，饲喂KD的小鼠肠道Th17频率显著降低(图4A)，与KD上双歧杆菌丰度显著降低一致(图4H)。观察到的肠道Th17细胞水平与双歧杆菌丰度并不直接成正比，因为双歧杆菌丰度随着饲料CHO的减少而逐渐下降，但仅在KD上肠道Th17细胞频率显著下降(图7D)(图4H)。此外，与HFD85 (5% CHO)相比，HFD89 (1% CHO)Th17细胞数量显著增加。这些结果表明，肠道双歧杆菌可能需要一个丰度阈值来诱导固有层的Th17细胞反应，或者其他宿主或微生物因素可能导致所观察到的Th17差异。其他免疫细胞亚群包括Th1(图7E)和Treg(图7F)细胞群均无明显变化。图6图7图S7

研究结论

    综上所述，饮食诱导的宿主代谢物改变肠道微生物群，并对免疫细胞产生下游影响。KD对肠道微生物群的影响不同于HFDs，部分原因是伴随宿主产生酮体。酮体抑制双歧杆菌生长导致与KD相关的肠道Th17细胞水平下降，也可能导致脂肪含量下降。自20世纪20年代起，KDs就被用作治疗难治性癫痫的饮食疗法。研究强调了肠道微生物群在介导肠道Th17细胞对KD消耗反应变化中的作用。我们关注的双歧杆菌在人类和小鼠摄入KD期间，以及在小鼠喂食合成KE时，数量都出现了可重复的减少，βHB具有抗炎作用，能够抑制NLRP3炎症小体。在KD过程中βHB的产生除了改变微生物介导的免疫调节外，还可以直接影响免疫应答。补充口服酮酯HFD表明，KD诱导的微生物群转移部分是通过宿主产生酮体介导的。在KD的情况下，CHO的限制和βHB都可能对双歧杆菌的显著减少起作用，二者并不是相互排斥的。

参考文献

Qi Yan Ang et al., Ketogenic Diets Alter the Gut Microbiome Resulting in Decreased Intestinal Th17 Cells.  Cell. 2020 Jun 11;181(6):1263-1275.e16

往期精彩：

---

苏州帕诺米克生物医药科技有限公司

诺米代谢

帕诺米克代谢组学平台

公众号：Bionovogene

服务热线：0512-62959105