【生化】Angew：新型荧光探针动态监测细胞活力
细胞活力的监测对于生物学、病理学和医学的基础研究至关重要。细胞活力的改变主要体现在细胞凋亡和坏死过程，更微观地体现在线粒体和细胞核状态的改变。目前，设计合成线粒体和细胞核双靶向的荧光探针来监测细胞活力已成为了一个研究热点。常见荧光探针的设计思路为：探针在正常细胞中靶向线粒体，在细胞凋亡时转而定位细胞核，从而达到细胞凋亡过程的动态可视化。然而已设计合成的探针存在诸多问题，如在线粒体和细胞核中荧光波长保持不变，探针存在的非均匀染色影响凋亡过程的判断，荧光强度易受干扰等。
近日，济南大学的林伟英教授课题组基于双靶向策略，设计合成了一种新型的双发射荧光探针MNQI，该探针在靶向健康细胞线粒体时发出深红色荧光；细胞凋亡时，探针迁移至细胞核并发出绿色荧光。MNQI由弱电子供体和喹啉阳离子基团组成，它本质上是疏水性阳离子，可以在健康细胞中靶向具有负线粒体膜电位（MMP）的线粒体。同时，MNQI与细胞核染色试剂Hoechst的结构相类似，具有DNA高亲和性，随着MMP在细胞凋亡过程中的减少，MNQI从线粒体释放并迁移到细胞核中，形成与DNA结合的单体并发出绿色荧光（图1）。进一步，作者通过光学性质研究、DNA亲和性研究和细胞共聚焦成像实验验证了MNQI从线粒体迁移至细胞核的动态过程。相关成果以“Dynamically Monitoring Cell Viability in a Dual-Color Mode: Construction of an Aggregation/Monomer-Based Probe Capable of Reversible Mitochondria-Nucleus Migration”为题发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201811459）。
图1 MNQI在线粒体/细胞核的转移机制及设计策略
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
首先，作者研究了MNQI在聚集及单体状态下的吸收和发射光谱（图2a）。在不同溶液体系中，单体状态下的MNQI在350～500 nm处均显示出强吸光度，最大发射峰均出现在570 nm。但是在聚集的固体状态下，MNQI在690 nm处显示出强荧光发射，这很好地证明了MNQI在聚集和单体状态下具备双发射能力。作者还研究了MNQI的晶体结构（图2b和2c），由于分子间静电相互作用，MNQI分子反平行堆积并形成结晶状态的二聚体。 二聚体单体之间距离为3.364 Å、3.340 Å和3.312 Å，表明二聚体内部存在强烈的分子内相互作用。此外，相邻二聚体之间距离为3.374 Å和3.390 Å，这表明相邻二聚体之间也存在强烈的分子间相互作用。分子间π-π相互作用完美地解释了固态MNQI发生红移的现象。作者通过分子对接计算发现MNQI与DNA具有理想的亲和力。
图2 MNQI在聚集/单体状态下的吸收和发射光谱及MNQI晶体结构分析
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
接着，作者研究了MNQI对线粒体和细胞核靶向能力（图3）。活细胞中MNQI的荧光信号与商业化线粒体探针的荧光信号大量重叠，共定位系数高达0.90，这表明MNQI在活细胞中具有良好的线粒体靶向能力。固定细胞（死细胞）中MNQI的荧光信号与商业化细胞核探针的荧光信号大量重叠，共定位系数为0.91，表明MNQI在死细胞中选择性靶向细胞核。因此，MNQI可成功地区分活细胞和死细胞。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
进一步，作者为了验证MNQI分布和MMP水平的关系，将碳酰氰基-对-氯苯腙（CCCP）与健康状态的HeLa细胞共孵育后进行共聚焦成像研究。结果显示，MNQI最初在健康细胞中靶向线粒体并发出红光荧光，当CCCP的加入量逐渐增大后，MMP水平逐渐降低，MNQI从线粒体中释放出来并迁移至细胞核发出绿色荧光（图4a）。当停止加入CCCP后，MMP水平得到恢复，细胞核中的绿色信号逐渐消失，这表明MNQI又迁移回线粒体（图4b）。荧光强度半定量分析结果直观地显示出MNQI在线粒体和细胞核中荧光强度比值的变化，证明了MNQI能根据MMP的水平在线粒体和细胞核中可逆迁移（图4c）。
图4 MNQI分布和MMP水平的关系
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
最后，作者对MNQI监测细胞凋亡的可行性进行了研究。鱼藤酮是一种可有效诱导细胞凋亡的毒物，通过干扰线粒体中的电子传递链并产生过量ROS诱导细胞凋亡。鱼藤酮预处理活HeLa细胞24 h后与MNQI共孵育成像结果如图5a所示。在未经鱼藤酮处理的对照组中，MNQI在线粒体中发出强烈的红色荧光而在细胞核中没有荧光信号。然而，经鱼藤酮处理的细胞中，MNQI发出强烈的绿色荧光，这表明MNQI能成功监测细胞凋亡进程。荧光强度半定量分析结果更直观地显示了MNQI在线粒体和细胞核的分布情况，更进一步验证了MNQI用于监测细胞凋亡的可行性（图5b）。
图5 （a）MNQI在正常的、经鱼藤酮预处理的HeLa细胞中共聚焦成像情况；（b）荧光强度半定量分析
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
总结：作者设计合成了一种新型的双发射荧光探针MNQI，该新型探针能够靶向健康细胞的线粒体，并发出深红色荧光；细胞凋亡时，探针会迁移至细胞核，并发出绿色荧光。因此，探针可以通过位置迁移和荧光颜色变化可逆地检测细胞健康状态，在细胞凋亡等生理、病理学研究中可发挥非常重要的作用。该研究为生物学、病理学和医学的基础研究提供了一种新思路。
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