美国特拉华大学Samuel L. Scinto和Joseph M. Fox课题组日前在Angewandte Chemie International Edition上发表了他们最新的科研成果，文献中介绍了四嗪化合物位点选择性修饰蛋白质分子的方法，并通过该方法实现一系列功能，包括四嗪手臂与亲二烯体化合物的生物正交反应、蛋白偶联、固相（亚氨基二乙酸镍（Ni-IDA）树脂）蛋白-蛋白交联，以及蛋白偶联物的固相纯化。
蛋白质位点选择性修饰（化学或者酶反应）一直以来都是蛋白质/多肽化学领域的热门研究内容，对于其下游的体内成像、蛋白质组学、药物分子设计、药物偶联、药物释放和材料科学都起到先导作用。在本研究中，作者选择了1,2,4,5-四嗪类化合物作为修饰蛋白的的标签，通过逆电子需求 Diels-Alder 反应（inverse electron demand Diels-Alder reaction）完成与亲二烯体化合物（反式-环辛烯）的偶联，从而实现蛋白-蛋白交联的目的。逆电子需求 Diels-Alder 反应是目前已知的反应速率最快的生物正交反应（k2 104 -
106 M-1 s-1），因此该反应体系获得了蛋白偶联领域的关注。四嗪偶联反应已经在细胞标记、体内成像和蛋白质组学方面取得了广泛应用。
除了与亲二烯体的特异性逆电子需求 Diels-Alder 反应之外，四嗪化合物作为配体还在配位化学领域得到关注。类似于2,2’-联吡啶官能团，2-吡啶基四嗪基团也可以与众多金属离子螯合，例如对称的双齿3,6-二(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪可以螯合有机溶剂中的Ni2+、Cu2+、Fe2+、Ag+等金属离子。作者利用了四嗪化合物固载化于亚氨基二乙酸镍（Ni-IDA）树脂的性质，开发了固相纯化修饰蛋白质的途径，并在此基础上实现了蛋白-蛋白固相交联的化学过程。在该文献中，研究者报道了这个亲和生物正交化学标签（Affinity Bioorthogonal
Chemistry Tag, ABC Tag）的双重作用，即固载并纯化修饰后的蛋白质，以及使用四嗪手臂介导快速且定量的蛋白偶联（图1A）。3-甲基-6-(2-吡啶基)四嗪手臂可将修饰后的蛋白螯合于固定化金属离子亲和色谱（Immobilized metal-ion
affinity chromatography, IMAC）树脂，并实现固相蛋白纯化的目的（图1B）。
图1. （A）亲和生物正交化学（ABC）标签介导的修饰蛋白与Ni(IDA)树脂的螯合、蛋白纯化以及生物正交反应；（B）吡啶基-四嗪标记的蛋白与Ni(IDA)树脂螯合示意图（蛋白：PDB_ID 3KZY）。（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
作者首先研究了多种四嗪化合物作为手臂的可行性。它们使用绿色荧光蛋白（green-fluorescen protein）作为待修饰的蛋白底物与图2中的各个四嗪化合物缩合，修饰后的蛋白经过凝胶过滤纯化，之后在Ni-IDA树脂上固载化。分析显示，四嗪化合物1a-1c蛋白没有产生任何固载，而1d 吡啶基-四嗪蛋白实现了最高的固载率（3.4 mg/ml）。在这个发现的基础上，研究者设计了双齿吡啶基-四嗪化合物1g，它的固载率高达9 mg/ml，是1d对应物的2.6倍。从这个筛选结果来看，吡啶基-四嗪修饰的蛋白可以与Ni-IDA树脂实现良好的螯合。
图2. 绿色荧光蛋白GFP的半胱氨酸残基被不同四嗪化合物选择性修饰。（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
研究者接下来使用酶催化的途径完成蛋白C端的定位修饰。一个序列为LPXTG的多肽被整合到目标蛋白（POI, protein of interet）C端。这个特殊序列可以被转肽酶A（Sortase A）特异性识别，并介导甘氨酸化合物与多肽底物之间的酰基转移反应。在该研究中，作者合成的含甘氨酸结构的吡啶基-四嗪化合物2（图3）在转肽酶A家族的SrtA7M的催化下，与八种C端为LPETGG识别序列的蛋白进行酶催化偶联反应，获得相应的POI-LPET-吡啶基-四嗪产物。反应体系被引入Ni-IDA树脂进行固相纯化。由于吡啶基-四嗪结构与Ni离子之间的螯合，那些没有得到修饰的蛋白经洗涤被除去，而修饰后的蛋白产物固载在了树脂之上。固化的产物经400 mM的咪唑磷酸盐缓冲液洗脱，得到72-95%的收率。
图3. C-端通过转肽酶催化偶联的蛋白混合物纯化过程。（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
为了检验蛋白N端标记的方法，研究者合成了吡啶基-四嗪化合物3以标记N端为半胱氨酸残基的蛋白单体链霉亲和素2（mSA2，图4）。在还原条件下（TCEP，三(2-羧乙基)膦）, 蛋白N端的半胱氨酸选择性地同化合物3的氰基成环，将吡啶基-四嗪化合物3偶合至目标蛋白N端。接下来的Ni-IDA树脂固化纯化法实现了mSA2-四嗪偶合产物88%的收率。
图4. mSA2蛋白的N端四嗪化合物修饰，以及固相纯化。（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
最后，研究者利用吡啶基-四嗪螯合Ni-IDA树脂的性质，测试了固相蛋白-蛋白交联反应。为了实现高转化率的交联反应，需要将没有得到修饰的蛋白杂质从反应体系中剔除，而之前研究的固相纯化法可以实现这个前提条件。为此，作者通过之前介绍的转肽酶法制备了Snap标记的蛋白5和6，其中5为C端环辛烯的蛋白，6为固化的吡啶基-四嗪Snag标记蛋白（图5A）。固化的6通过Ni-IDA树脂螯合并洗脱未修饰的杂质，5的反应液则未经纯化直接加入6树脂的填充柱体系。反应液经2分钟流出填充柱，未偶合的蛋白被直接洗脱。反应物5上的环辛烯与反应物6上的四嗪结构在该反应过程中，通过逆电子需求 Diels-Alder 反应形成二氢哒嗪环状化合物，从而将两个体系的蛋白在固相上交联起来，最终通过洗脱得到交联蛋白产物7。该反应的成功，促使研究者研究更复杂的异源三聚体蛋白的交联过程。为实现这一目标，双齿吡啶基-四嗪修饰的绿色荧光蛋白GFP-(pyTz)2（1g）首先被固化在Ni-IDA树脂上，得到反应物8。一个C端被环辛烯修饰的硫氧还蛋白9被投入8树脂的反应柱，使用同样的手段，成功制备了异源三聚体蛋白产物GFP-(Trx)=2（10，图5B）。
图5. 固相蛋白交联反应。（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
该研究利用了四嗪（双烯体系）与环辛烯（亲双烯体）之间快速的逆电子需求 Diels-Alder 反应，以及吡啶基-四嗪化合物的螯合金属离子的性质，开发出四嗪化合物位点选择性修饰蛋白的反应，以及修饰后的蛋白在亚氨基二乙酸镍 (Ni-IDA) 树脂上进行螯合的固相纯化手段。使用该方法，研究者进一步拓展了该生物正交反应标签，实现了在不纯化蛋白反应物的前提下，在固相树脂上完成蛋白交联反应，以及自动纯化过程。
Affinity
Bioorthogonal Chemistry (ABC) Tags for Site-selective Conjugation, On-Resin
Protein-Protein Coupling, and Purification of Protein Conjugates
Samuel
L. Scinto* Tyler R. Reagle, Joseph M. Fox*Angew.
Chem. Int. Ed. DOI: 10.1002/anie.202207661
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