【生化】J. Med. Chem.：用于新药研发的FAD依赖性组蛋白赖氨酸去甲基化酶的结构和功能概述

研究背景

组蛋白甲基化是最重要的翻译后修饰之一，参与包括染色质重塑、转录控制和基因表达调控在内的多种生物学过程。FAD依赖性赖氨酸去甲基化酶由赖氨酸去甲基化酶1（LSD1）和赖氨酸去甲基化酶2（LSD2）两个成员组成，其在许多重要的细胞过程中发挥重要作用，如细胞分化、增殖和干细胞的自我更新。靶向FAD依赖性赖氨酸去甲基化酶已被公认为是治疗癌症、神经退行性疾病和病毒感染等人类疾病的一种有前景的治疗方法。目前在基于结构生物学设计靶向组蛋白去甲基化酶催化位点的高效选择性抑制剂方面取得了重大进展。迄今为止，9种LSD1抑制剂即苯环丙胺、IMG-7289、INCB059872、GSK-2879552、ORY-1001、ORY-2001、TAK418、SP-2577和CC-90011已作为单药或联合治疗进入临床试验（图1）。相比之下，LSD2的生物学功能和抑制剂开发仍处于非常早期的阶段。了解LSDs亚型结构域特征以及LSD抑制剂独特的作用方式，将有益于鉴定选择性LSDs抑制剂，用于探索LSDs在治疗人类疾病中的临床应用价值。

图1：LSD1 临床期抑制剂（来源：Journal of Medicinal Chemistry）

通过靶向LSDs经典的去甲基化酶依赖性功能，LSDs靶向药物取得了很大进展，多种LSD1抑制剂已在临床试验中进行评估。鉴于此，郑州大学药学院的余斌教授和宋宜辉副教授针对FAD依赖性组蛋白赖氨酸去甲基化酶的结构和功能进行了系统综述。作者对LSD家族的完整结构和功能进行概述，全面总结并分析了包括天然产物、多肽和合成化合物在内的不同类型LSD抑制剂的作用模式和结构-活性关系(SAR)，并且首次根据各类抑制剂独特的结合模式将其分为三种类型。最后，作者对靶向LSD经典的去甲基化酶药物研发策略的前景和挑战进行了展望，旨在为靶向LSD经典的去甲基化酶药物研发提供全新的思路和研究方向。相关成果以“Structural and Functional Landscape of FAD-Dependent Histone Lysine Demethylases for New Drug Discovery”为题发表在Journal of Medicinal Chemistry（DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c01324）。

成果简介

1. 组蛋白赖氨酸去甲基化的生物学功能

FAD依赖的赖氨酸去甲基化酶参与多种细胞过程，包括信号转导、转录调控、染色质重塑、细胞增殖分化、神经退行性病变、脂质代谢等。FAD依赖性赖氨酸去甲基化酶的失调与包括急性淋巴细胞白血病(ALL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、乳腺癌、尤文肉瘤和胰腺癌在内的多种肿瘤疾病的发生、侵袭和转移密切相关。基于底物特异性，LSD1在包括细胞增殖、分化、染色体分离和胚胎发育在内的众多生物学过程中发挥着不同的作用，除了肿瘤学作用，LSD1能够与SARS-CoV-2的血管紧张素转换酶2(ACE2)共定位，还参与单纯疱疹病毒(HSV)感染和神经退行性变发生。LSD2是FAD依赖性赖氨酸去甲基化酶家族中唯一的LSD1同系物，与LSD1具有相似的H3K4/9去甲基化酶活性。此外，LSD2也可以通过其内在的去甲基化酶活性调节H3K36me2的甲基化水平。此外，除了在癌症中的作用，LSD2还能够通过介导表观基因组和代谢之间的交互对话来抑制肝细胞中的脂质内流和代谢。

图2：依赖性赖氨酸去甲基化酶的生物学功能（来源：Journal of Medicinal Chemistry）

2. FAD-依赖性赖氨酸去甲基化酶的结构特征

尽管LSD1和LSD2的序列和催化机制相似，但其结构不同。LSDs的不同结构域体系使其与不同的辅助因子结合，从而显示不同的功能。人LSD1全长有852个残基，由非结构N端区域、SWI3/Rsc8/Moira(SWIRM)结构域、Tower结构域和催化胺氧化酶结构域(AOD)组成（图3A）。N端区域（1-172位残基）可在特异性赖氨酸残基上发生甲基化，并为KDM1A K114me2阅读器chromodomain-helicase-DNA结合蛋白1(CHD1)提供结合位点，以驱动前列腺素受体介导的转录和易位（图3B）。SWIRM结构域（残基172-271）由中央长螺旋分隔的α-螺旋束组成，可与AOD催化结构域结合，并通过蛋白质-蛋白质和DNA-蛋白质相互作用稳定与多种底物如核小体、转录因子和DNA等的相互作用（图3）。与黄素非依赖性胺氧化酶的其它成员不同，以卷曲螺旋结构为特征的Tower结构域（残基418-522）从C-末端AOD突出，将AOD分成两部分（残基271-417和523-833）（图3A）。催化腔位于AOD结构域中，在LSD1去甲基化和底物识别中起重要作用。AOD含有非编码RNA和转录因子SNAIL的结合位点。SNAIL的N端SNAG结构域通过模拟H3尾部招募LSD1到SNAIL1的靶向基因启动子进行转录抑制（图3B）。独特的Tower结构域为CoREST招募LSD1到核小体提供了结合位点，对于LSD1的去甲基化酶活性不可或缺（图3B）。

图3：LSD1三维结构（来源：Journal of Medicinal Chemistry）

LSD2与LSD1共享两个保守结构域：SWIRM结构域（24%序列同源性）和催化AOD结构域（33%序列同源性）（图4）。因此，两种酶显示出几乎相同的H3K4me1/2去甲基化酶活性。与LSD1相似，LSD2的SWIRM结构域（残基287-371）也通过氢键和疏水键与AOD（残基372-822）产生相互作用。局部结构差异表明LSD2的AOD可能与不同的蛋白质发生相互作用，并表现出不同的生物学功能。值得注意的是，LSD2在N端含有一个独特的锌指结构域，它在控制LSD2的去甲基化酶活性以及与FAD的非共价结合中起着至关重要的作用。锌指结构域由一个保守的C4H2C2型锌指（残基50-136）、一个CW型锌指（残基137-190）和一个连接区（残基191-286）组成，是LSD2去甲基化酶活性所必需的。

图4：LSD2三维结构（来源：Journal of Medicinal Chemistry）

FAD依赖性赖氨酸去甲基化酶属于黄素非依赖性胺氧化酶（FAO）超家族。FAD依赖的赖氨酸去甲基化酶中AOD的核心结构高度保守，通过折叠成FAD和底物结合亚结构域，AOD在两个亚结构域之间的界面上形成了一个大的空腔作为酶催化中心（图5）。具有漏斗状活性位点的LSD1和LSD2的催化空腔比其他胺氧化酶大得多，形成了独特的底物结合位点。对AOD催化中心的结构解析可为合理设计强效和选择性抑制剂提供重要信息。FAD辅酶的整体结构和配位残基在LSD1和LSD2中高度保守，尤其是催化残基Lys661的位置。LSD1和LSD2中FAD的异丙恶嗪环均紧密位于由残基Val317/Val421、Ala331/Ala436、Met332/Gln437、Val333/Ile438、Phe538/Tyr545、Leu659/Ile659、Asn660/Glu660、Lys661、Trp695/Tyr698、Ser749/Thr755、Ser760/Ala766和Tyr761/Tyr767组成的疏水口袋中（图5）。这种保守的特征产生了难以区分的催化腔，从而赋予了相似的底物特异性。

图5：FAD依赖性赖氨酸去甲基化酶的催化中心（来源：Journal of Medicinal Chemistry）

3. 靶向FAD依赖性赖氨酸去甲基化酶抑制剂的结合模式

迄今为止，已经报道了许多经典靶向LSD1去甲基化依赖性功能的抑制剂，而LSD2抑制剂的开发尚且处于初始阶段。直到现在，9种LSD1抑制剂（包括反苯环丙胺、IMG-7289、INCB059872、GSK-2879552、ORY-1001、ORY2001、TAK-418、SP-2577和CC-90011）已作为单药或联合治疗进入临床试验，用于治疗发育障碍或癌症（图6）。相比之下，只有苯环丙胺类似物被鉴定为LSD2抑制剂，IC₅₀值在微摩尔范围内。根据LSD1抑制剂的结合方式，作者首次将其分为三种类型：（a）在FAD结合口袋与FAD形成共价加合物的I型抑制剂（如苯环丙胺衍生物；GSK2879552；TAK-418；苯乙肼）；（b）在H3K4的口袋结合的II型抑制剂（如肽衍生抑制剂；多粘菌素B和E；CC-90011）；（c）通过采用独特的多拷贝堆叠结合模型（如E11；MC3767）位于H3识别位点的III型抑制剂（图6）。阐明靶向LSDs的化合物独特的结合模型和构效关系将有利于基于结构设计更高效、选择性更强的新型LSDs抑制剂。

图6：抑制剂的三种结合类型（来源：Journal of Medicinal Chemistry）

结论与展望

靶向组蛋白赖氨酸去甲基化酶LSDs家族代表了治疗包括癌症、神经退行性疾病等多种疾病的一种有前景的治疗策略。除了保守的催化结构域，LSDs还包含独特的结构域，通过蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸相互作用与其他辅助因子反应，介导非催化功能。经典的去甲基化酶依赖性功能和新发现的去甲基化酶非依赖性功能均为靶向组蛋白赖氨酸去甲基化酶LSDs的新药发现提供了机遇。然而，LSDs复合物的有限的结构生物学信息阻碍了靶向LSDs去甲基化酶非依赖性功能的药物发现。因此，有必要明确LSD非催化功能的结构基础。

通过靶向LSDs经典的去甲基化酶依赖性功能，LSDs靶向药物发现取得了很大进展，几种LSD1抑制剂正在临床试验中进行评估。X射线晶体结构显示，化合物与催化赖氨酸残基Lys661或带正电荷的氨基酸（Asp553和Asp555-556）之间的相互作用对LSD1抑制剂发挥抑制活性至关重要。但是不可逆LSD抑制剂可以抑制其它蛋白（如P2Y12受体、二肽基肽酶IV和环氧化物水解酶）或含FAD的酶，从而可引起潜在的脱靶和选择性问题。尤其是2-PCPA衍生物可通过与药物代谢酶CYP450相互作用，引起对人体不利的潜在的药代动力学相互作用。此外，LSD1的基因缺失或敲除可导致小鼠ESC早期死亡和人造血系统的全血细胞减少，表明抑制LSD1的潜在靶向毒性。以上这些问题虽并不详尽，但仍对LSD1不可逆抑制剂的临床应用提出了挑战。相反，可逆性LSD1抑制剂由于毒性低引起了广泛关注。在保守催化位点之外的新的可成药位点（如LSD1的SWIRM/AOD、SANT2/Tower和AOD/Tower界面的铰链区）可能为发现新的LSD抑制剂提供机会，破坏这些相互作用可能为开发选择性LSD1抑制剂提供潜在的方法。此外，阻断LSD1/CoREST与染色质或各种蛋白伴侣（如FBXW7和ZNF217）的结合也是发现调节LSD1去甲基化酶非依赖性功能的新型LSD1抑制剂提供了方向。与LSD1相反，LSD2抑制剂却鲜有报道。除了经典的去甲基化酶作用，LSD2还作为E3泛素连接酶发挥作用。由于锌指结构域在LSD2的组蛋白去甲基化酶依赖和去甲基化酶非依赖性功能中的重要作用，靶向特异性锌指结构域也可能是LSD2抑制剂的一种有前景的设计策略。

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