教你如何定义新亚群 | 在单细胞水平上解析人肝硬化的纤维化微环境

Original Tiger 生信宝典 2022-03-28

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-----------教你如何定义新亚群

我们都知道单细胞转录组测序的关注点一直是

（1）异质性；
（2）发育；
（3）新亚型。

Liver cirrhosis is a major cause of death worldwide and is characterized by extensive fibrosis. There are currently no effective antifibrotic therapies available. To obtain a better understanding of the cellular and molecular mechanisms involved in disease pathogenesis and enable the discovery of therapeutic targets, here we profile the transcriptomes of more than 100,000 single human cells, yielding molecular definitions for non-parenchymal cell types that are found in healthy and cirrhotic human liver. We identify a scar-associated TREM2+CD9+ subpopulation of macrophages, which expands in liver fibrosis, differentiates from circulating monocytes and is pro-fibrogenic. We also define ACKR1+ and PLVAP+ endothelial cells that expand in cirrhosis, are topographically restricted to the fibrotic niche and enhance the transmigration of leucocytes. Multi-lineage modelling of ligand and receptor interactions between the scar-associated macrophages, endothelial cells and PDGFRα+ collagen-producing mesenchymal cells reveals intra-scar activity of several pro-fibrogenic pathways including TNFRSF12A, PDGFR and NOTCH signalling. Our work dissects unanticipated aspects of the cellular and molecular basis of human organ fibrosis at a single-cell level, and provides a conceptual framework for the discovery of rational therapeutic targets in liver cirrhosis.

该篇文章由英国爱丁堡大学炎症研究中心Henderson教授团队于2019年10月9日正式于Nature发表，作者在对新细胞亚群的验证和定义方面都提出了很好的思路，对我们区分细胞亚型意义重大。

研究背景

最近的估计表明，全世界有8.44亿人患有慢性肝病，每年有200万人死亡，并且发病率不断上升。继发于任何原因的反复性肝损伤会导致进行性纤维化，并最终导致肝硬化。值得注意的是，肝纤维化程度预示了不良的患者预后。因此，迫切需要针对慢性肝病患者的有效抗纤维化疗法。

肝纤维化涉及多个非实质细胞（Non-Parenchymal Cells，NPC）谱系之间的复杂相互作用，包括空间上位于瘢痕形成区域内的免疫，内皮和间充质细胞，称为纤维化龛。尽管我们对使用啮齿动物模型获得的肝纤维化有一定的发现，但假定的靶标和有效的患者治疗方法之间仍然存在相当大的“转化鸿沟”。部分原因是由于对细胞谱系的功能异质性和相互作用组的定义有限，导致人类肝硬化的纤维化生态位不能被被啮齿动物模型完全概括。

研究方案

Sample：肝脏组织，包括5个正常肝脏组织和5个肝硬化组织，4个外周血样本，作者通过流式分选对非实质细胞进行单细胞转录组测序（评：现在的多数有关肿瘤微环境的单细胞测序均会采用流式分选，保证所需细胞的比例。该文章使用不同的流式抗体进行分选，但由于某些间质细胞的marker的selectively expression，也有许多文章采用”阴选“即用肿瘤抗体进行流式分选，剩下的细胞进行转录组测序。）

单细胞建库流程+实验设计流程：10X3’ genomics

测序数据分析介绍

工具：Chromium Single Cell 3′ Library and Gel Bead Kit v2 (10X Genomics, PN-120237) and the Chromium Single Cell A Chip Kit (10X Genomics, PN-120236);
比对：GRCh38
筛选：Genes expressed in fewer than three cells in a sample were excluded, as were cells that expressed fewer than 300 genes or mitochondrial gene content >30% of the total UMI count.
降维，聚类：Seurat R package V.2.3.0（PCs:PC2:PC11）
处理污染：combined all human scRNA-seq datasets (liver and blood) and performed clustering analysis with the aim of isolating a population of liver-resident cells, by identifying contaminating circulatory cells within datasets generated from liver digests and removing them from downstream analysis。（评：该步骤在数据处理中也是较为少见的，为了处理循环细胞对组织的污染，我们通常情况下是进行灌洗，这样可以去除多数循环细胞，而肝脏的丰富血流其实并不支持利用这一点。）
去除dropout：scImpute R pakage v.0.0.8
基因聚类：self-organizing maps approach as implemented in the SCRAT R package v.1.0.0
伪时序分析：monocle R package v.2.6.1 /velocyto R package v.0.6.0

结果分析

(1)去除循环白细胞对数据分析的影响。

作者使用流失分选将白细胞（CD45+ ）和其他非实质细胞进行分选（CD45−），同时作者对外周血中的PBMC（CD45+ CD66−）也进行单细胞测序（Hemberg-lab单细胞转录组数据分析（二）- 实验平台）并将组织和PBMC的dataset混合，发现cluster13和cluster1在两种组织中重合，作者认为其为外周血中的一部分，在后续分析中将其去除。（评：作者在上图f中发现驻留和循环的同种细胞的基因表达有所区别，组织中表达驻留marker如CXCR4,我们发现这种驻留性质其实对于聚类影响极大，如肺中的驻留marker CD69,CD103等）

图1

（2）人体肝脏NPC单细胞图谱。

重新聚类来自10个肝脏的66,135个肝驻留细胞（n = 5个健康肝，n = 5个肝硬化），发现21个种群（上图1b），每个细胞都包含健康和肝硬化肝的细胞（图1c），跨越10个细胞谱系（图1d，扩展数据图2a，b）。

在所有聚类和谱系中鉴定出亚群标记（图1e）。I型和III型胶原是纤维化小生境中的主要原纤维胶原，其表达仅限于间充质谱系细胞。作者提供开放式基因浏览器（http://www.livercellatlas.mvm.ed.ac.uk），该浏览器可以评估健康和肝硬化肝脏之间NPC基因的表达。（评：注意作者在这里列举的并不是所谓的marker而是高变基因，如T细胞并不是通过CD2而是通过CD3D,E,G进行区分）

Hemberg-lab单细胞转录组数据分析（十二）- Scater单细胞表达谱tSNE可视化

图2

（3）纤维化龛中存在不同类型的巨噬细胞。

先前在啮齿动物中的研究发现巨噬细胞亚群可以协调肝纤维化的进展和消退。作者在单核吞噬细胞（MPs）的聚类确定了十个亚群，标注为与瘢痕相关的巨噬细胞（SAMac），库普弗细胞（KC），组织单核细胞（TM），常规树突状细胞（cDC）和循环（增殖）细胞（图2a）。通过分别量化每个肝脏的MP细胞组成，证实了肝硬化肝脏中的MP（4）和MP（5）簇分别命名为SAMac（1）和（2）（图 2c）。

cluster MP（6）和MP（7）高表达CD163，MARCO和TIMD4，组织染色证实它们为KCs（驻留的肝巨噬细胞）。与瘢痕相关的cluster SAMac（1）和SAMac（2）表达了独特的标记物TREM2和CD9（图2d，e）。这些巨噬细胞表现出混合表型，具有TMs和KCs的特征（图2d，e），类似于小鼠肝损伤模型中单核细胞衍生的巨噬细胞。流式证实了TREM2 + CD9 +巨噬细胞在人纤维化肝脏中的扩增（图2f）。荧光激活细胞分选（FACS）后，来自SAMacs的条件培养基可促进人原代肝星状细胞（HSC）的原纤维胶原蛋白表达（图2g），表明SAMacs具有促纤维化表型。组织染色显示TREM2 + CD9 + MNDA + SAMacs局部存在于胶原蛋白阳性疤痕区域（图2h），并在肝硬化肝脏中显着扩展。(评：该分析步骤是本文中为最关键的一步，把新型的细胞亚群与临床表型相关联，并验证其新亚型在功能实验中的促纤维化)

单细胞分群后，怎么找到Marker基因定义每一类群？

（4）SAMacs的促纤维化表型。

作者使用自组织映射SOM对MP亚群中协调表达的基因组进行分析，确定了六个不同metagene signatures，记为A–F。其中signature A和B定义了SAMac，在GO富集分析中发现其与组织纤维化相关。这些定义SAMac的特征基因包括TREM2，IL1B，SPP1，LGALS3，CCR2和TNFSF12等，其中一些已知在纤维化性肝病中调节产生瘢痕的成纤维细胞的功能。

GO、GSEA富集分析一网打进

图3

（5）确认SAMacs细胞来源。

为了评估SAMac的起源，作者对外周血单核细胞和肝脏驻留MP的组合数据集轨迹分析。（图3a）沿着伪时间轨迹绘制图谱并通过剪接和未剪接的mRNA比率（RNA velocity）观察它们的方向性。这些分析表明从外周血单核细胞分化为SAMacs或cDCs，没有从KCs分化为SAMacs，也没有从SAMacs分化为KCs（图3a）。这些数据表明SAMac是单核细胞衍生的，代表了纤维化龛内的终末分化细胞状态。

为了进一步表征SAMac表型，作者使用monocle鉴定了沿单核细胞分化轨迹差异表达的基因并定义了三个基因共表达模块，模块1代表血液单核细胞到SAMac分化过程中的上调基因（图3c）。模块1包含多个促纤维化基因，包括SPP1，LGALS3，CCL2，CXCL8，PDGFB和VEGFA10,11,12,13，GO分析显示与促进组织纤维化和血管生成有关（图3c，d）。模块2包含在单核细胞分化为SAMac的过程中被下调的基因（图3c），而模块3包含了从单核细胞分化为cDCs的过程中上调的基因（图3c）。（评：我们发现作者在此时同时应用了monocle和velocity两种伪时序分析，个人认为Velocity的伪时序分析可能更有生物学含义，但也有人应该用Velocity不能阐明其生物学逻辑，所以应用多种软件可以排除工具依赖性，保证数据可靠）

NBT|45种单细胞轨迹推断方法比较，110个实际数据集和229个合成数据集

（6）跨物种鉴定新型细胞亚型。

为了进行跨物种比较，作者制作肝纤维化的小鼠模型并分离的肝MP细胞进行了scRNA-seq测序，证实了该CD9 + mSAMac群体在肝纤维化中的扩展，并且mSAMacs与原代小鼠HSCs共培养促进了HSCs中纤维状胶原的表达。人和小鼠MP数据集进行CCA分析表明，人和小鼠SAMacs聚类在一起，并且该cluster富含SAMac标记CD9，TREM2和SPP1，证实了小鼠SAMac与人类SAMac相同。

总之，这些数据表明TREM2 + CD9 + SAMacs来自循环单核细胞的募集和分化，在物种间保守，显示促纤维化表型，并在肝病进展过程中早期扩展。

图4

（7）纤维化龛中内皮细胞亚群分析。

在啮齿动物模型中，已知肝内皮细胞可调节纤维发生。人肝内皮细胞的聚集鉴定出七个亚群（图4a）。疾病相关内皮细胞Endo（6）和Endo（7）（分别为CD34 + PLVAP + VWA1 +和CD34 + PLVAP + ACKR1 +；图4a–c）在肝硬化肝组织中扩展（图4e），并且仅限于纤维化龛（图4d，e），分别标注为与瘢痕相关的内皮SAEndo（1）和SAEndo（2）。

Metagene特征分析表明Endo（6）（SAEndo（1））细胞表达促纤维化基因，包括PDGFD，PDGFB，LOX ；和LOXL2；GO分析包括细胞外基质形成；Endo（7）（SAEndo（2））细胞表现出免疫调节表型。该cluster的标志物ACKR1在调节白细胞募集中发挥了作用。ACKR1敲低后发现白细胞迁移能力减弱。

图5

（8）PDGFRA表达定义SAMes细胞。

肝间充质细胞鉴定出四个亚群（图5a，b），以MYH11表达区分cluster Mes（1）（图5b）为被鉴定为血管平滑肌细胞（VSMC）（图5c）。Mes（4）证明了间皮标志物的表达（图5b，扩展数据图9a）。Mes（2）表达高表达RGS5（图5b）。簇Mes（3）（通过PDGFRA表达区分）表达高水平的原纤维胶原蛋白和促纤维形成基因（图5b，d）.PDGFRα+细胞在肝硬化肝中扩增（图5b）并被映射到纤维化的生态位（图5f），注释为与瘢痕相关的间充质（SAMes）细胞。

图6

（9）纤维化龛中的多谱系相互作用。

作者使用CellPhoneDB进行了无偏向的配体-受体相互作用分析，SAMacs表达表皮生长因子受体（EGFR）并且已知可调节间充质细胞活化的配体（图6a）。此外，SAMacs表达了间充质细胞促分裂原TNFSF12和PDGFB，向SAMes上的同源受体TNFRSF12A和PDGFRA发出信号（图6a）。

纤维化生态位中的这些配体-受体对（图6b）TNFSF12和PDGF-BB均可诱导原代人HSC的增殖，这种增殖通过分别阻断TNFRSF12A和PDGFRA受到抑制（图6c，d）。SAEndo细胞表达高水平的Notch配体JAG1，JAG2和DLL4与SAMes细胞上的Notch受体NOTCH3相互作用（图6e）。

在纤维化龛中的PDGFRα+ SAMes细胞（图6f）发现NOTCH3 高表达，以及来自内皮细胞的原代内皮细胞中鉴定到肝硬化的人肝表现出JAG1的表达增加（图6g）。原代人HSC和肝硬化的内皮细胞的共培养促进了HSC的原纤维胶原蛋白的产生（图6h）。在原代人HSC中敲低NOTCH3表达导致原纤维胶原表达降低（图6i）。

单细胞文章点评

1. 该篇文章其实在对新型细胞亚型的鉴定方面为我们提供了许多思路：

     1）确认该新型亚群具有特异性marker和表型（使用共孵育或选择性培养基）；

     2）确认新型细胞来源（使用monocle或velocity）

     3）该亚群跨物种保守；

     4）具有pro-fibrogenic表型；

     5）在肝硬化中比例扩大；

2. 该文献利用了SOM自组织加权，数据的多样化和可视化更强；（SOM基因表达聚类分析初探）

3. 作者在最后配受体之间的相互作用时利用了CellPhoneDB,但由于CellPhoneDB中的配受对实在太多，有时候挑选依然非常困难，如果只做免疫相关的基因配受体，可以参考北大张泽民团队于Cell发表的《Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma》附表中的有关免疫的配受体对。

参考文献

Ramachandran P, Dobie R, Wilson-Kanamori JR, Dora EF, Henderson BEP, Luu NT, Portman JR, Matchett KP, Brice M, Marwick JA, Taylor RS, Efremova M, Vento-Tormo R, Carragher NO, Kendall TJ, Fallowfield JA, Harrison EM, Mole DJ, Wigmore SJ,Newsome PN, Weston CJ, Iredale JP, Tacke F, Pollard JW, Ponting CP, Marioni JC,Teichmann SA, Henderson NC. Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level. Nature. 2019 Nov;575(7783):512-518. doi:
10.1038