里程碑！PNAS | 人源全长PI3Kα复合物三维结构成功解析（附：邵峰院士、叶德全院长点评）

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王明伟/杨德华团队

2021年11月2日（北京时间），中国科学院上海药物研究所王明伟/杨德华团队携手美国Scripps研究所Peter K. Vogt团队于《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS）在线发表了题为“Cryo-EM structures of PI3Kα reveal conformational changes during inhibition and activation”的研究成果。该论文首次报道了人源全长磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）α亚型（p110α-p85α）蛋白复合物的冷冻电镜结构，并通过研究PI3Kα的三种构象（野生型异二聚体、与亚型特异性抑制剂BYL-719结合的异二聚体和经磷酸肽活化的异二聚体）揭示了每种构象之结构特征，为深入认识PI3Kα发挥信号转导功能的分子机制和相关新药研发提供了重要的信息。

PI3K是一种广泛存在于胞内、主司信号转导的脂质激酶，参与调节包括细胞生长和增殖等在内的多种生理活动^1-3。PI3K分为I、II和III三个类别，其中I类PI3K与肿瘤和疾病的相关性最高⁴。PI3Kα属于IA类，以异二聚体的形式存在，由催化亚基p110α和调节亚基p85α组成，其中编码p110α的基因PIK3CA是第二常见的致癌基因，在某些肿瘤类型中存在高达30%的突变率^5,6。PI3K-AKT-mTOR是肿瘤中最常见的失调信号通路之一⁴，其中PI3K作为药物作用靶点受到广泛的关注。由于p110α与p85α共表达所形成的复合物极不稳定，故以往解析的大多是部分截短的p85α复合物晶体结构，尚无全长序列冷冻电镜结构的报道。

参加这项研究的科研人员经过反复优化实验条件获得了颗粒均一且性状稳定的蛋白复合物，借助中国科学院上海药物研究所300 kV冷冻电镜拍摄到的清晰图像和后继单颗粒三维重构获得了整体分辨率为2.65 Å的全长野生型p110α-p85α复合物的立体结构（图1A）。该结构显示，与先前发表的晶体结构（PDB: 2RD0和4OVU）相比，其部分区域发生偏移，尤以ABD-iSH2结构域为甚，在S505的Cα处的偏移为6.9 Å（图1B）。此外，3DVA显示DFG基序也包含了DFG-out的构象（图1C）。

图1. A，人源全长野生型p110α-p85α复合物的冷冻电镜结构。B，与晶体结构（蓝色）对比，ABD和iSH2结构域在S505的Cα处位移6.9 Å。C，3DVA显示DFG基序包含DFG-out之构象。

研究人员进而解析了PI3Kα在抑制状态下（即在特异性抑制剂BYL-719作用下）整体分辨率为2.87 Å的冷冻电镜结构（图2A）。BYL-719（商品名为Alpelisib）是由瑞士诺华公司研发的首款特异性PI3Kα抑制剂，2019年上市，与氟维司群联用治疗性激素受体（HR）阳性、HER2阴性和PIK3CA突变的晚期或转移性乳腺癌。通过与相关晶体结构（PDB: 4JPS）比较，冷冻电镜结构显示与野生型异二聚体类似的特征。在p85α的iSH2结构域与p110α的激酶结构域附近存在额外密度，使用1% FDR confidence map与相关晶体结构生成的模型（图2B）推测出SH3、BH和cSH2结构域之可能位置。

图2. A，人源全长野生型PI3Kα-BYL-719复合物的冷冻电镜结构模型。B， PI3Kα-BYL-719结构中的额外密度，生成的拟似模型指向cSH2结构域为红色部分、BH结构域为绿色部分以及SH3结构域为橙色部分。

激活状态的PI3Kα通过将野生型复合物与其上游信号分子PDGFRB（血小板源性生长因子受体β）的磷酸肽结合制备而得。在生化实验支持下，研究人员通过对冷冻电镜数据的分析发现，p110α的催化核心由RBD、C2、螺旋区和激酶结构域组成，形成刚性基团；而p85α和p110α的ABD结构域较之p110α的催化核心展示为柔性构象（图3），从而阐明了传递上游信号时PI3K构象变化的结构特征。由此引发的问题是功能获得性突变（具有结构性酶活性）是否也会产生类似的变化，特别是G106V突变。

图3. 催化核（左侧）和PI3Kα（右侧）的结构模型。

美国科学院院士、Scripps研究所Peter K. Vogt教授、中国科学院上海药物研究所/复旦大学王明伟讲座教授和中国科学院上海药物研究所杨德华研究员为该论文的共同通讯作者，复旦大学药学院硕士研究生刘晓和Scripps研究所杨苏博士为共同第一作者，他们和Scripps研究所Jonathan R. Hart博士对本成果做出了同等贡献，合作者包括浙江大学张岩教授、华中科技大学夏天教授和复旦大学基础医学院周庆同青年研究员等。该课题先后获得了国家自然科学基金委员会、国家科学技术部、国家卫生健康委员会、中国科学院‒诺和诺德研究基金和美国国立卫生研究院的经费资助。

专家点评

中国科学院院士、北京生命科学研究所学术副所长邵峰博士：

该工作首次用冷冻电镜技术，解析了全长、人源PI3K（p110α与p85α）激酶复合物在不同活性状态下的高分辨结构。鉴于PI3K对细胞增殖和癌症发生有着广泛和重要的作用，也是靶向抗癌药物研发的热门靶点，该结构对相关药物研发有着积极的指导价值。

香港中文大学（深圳）生命与健康科学学院讲座教授、院长叶德全博士：

磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）是一类脂质激酶，广泛分布于人体各类组织细胞中，参与跨膜信号转导活动，进而调节细胞生长、增殖和活化等重要生理功能。鉴此，多个跨国药企将PI3K作为药物靶标，近二十年来坚持不懈地筛选PI3K抑制剂。PI3K可分为I、II和III三个大类，而针对不同种类的特异性抑制剂可望干预特定的信号通路，成为有效的治疗药物。由于I类PI3K的α亚型与肿瘤和多种疾病的发生发展关系密切，所以了解其结构和构象，将有助于开发这些创新药物。 《美国国家科学院院刊》（Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS）于美东时间11月1号在线发表了由中国科学院上海药物研究所王明伟/杨德华团队携手美国Scripps研究所Peter K. Vogt团队合作完成的三个全长PI3Kα复合物冷冻电镜结构，其论文题为“Cryo-EM structures of PI3Kα reveal conformational changes during inhibitionand activation”。这一成果通过单颗粒冷冻电镜技术的运用，成功地解析了由催化亚基p110α和调节亚基p85α组成的蛋白质结构，经三维重构得到分辨率为2.65 Å的全长野生型p110α-p85α复合物的立体结构，以及与PI3Kα特异性抑制剂BYL-719结合的复合物结构和与血小板源性生长因子受体β磷酸肽结合产生的活化态复合物结构。这一系列工作补充并完善了之前发表的PI3Kα晶体结构，而多种不同状态下PI3Kα结构的解析则超越了之前的发现，对于阐明PI3Kα的活化机理及p110α在肿瘤发生中的作用，有着重要的指导意义。

PI3Kα与BYL-719（金色所示）结合在两个取向上的冷冻电镜密度图和模型示意图。

王明伟/杨德华团队近年来成功报道了多个G蛋白偶联受体的分子结构。该团队与上海药物研究所其他团队及浙江大学的同仁合作，为解析B1类G蛋白偶联受体亚家族（共15个成员）的三维结构做出了举世瞩目的贡献。本次与Peter Vogt教授合作并成功完成全长p110α-p85α三个复合物结构的分析，是王明伟/杨德华团队向G蛋白偶联受体之外的生物大分子领域拓展的重要进展，同时彰显了国内结构生物学研究水平不断提升并形成引领态势的良好学术氛围。

原文链接：

• https://doi.org/10.1073/pnas.2109327118

参考文献：

1. Katso R, et al. (2001). Cellular function of phosphoinositide 3-kinases: implications for development, homeostasis, and cancer. Ann Rev Cell Dev Biol, 17, 615-675.
2. Castellano E, et al. (2016). RAS signalling through PI3-Kinase controls cell migration via modulation of Reelin expression. Nat Commun, 7, 11245.
3. Yu JS and Cui W (2016). Proliferation, survival and metabolism: the role of PI3K/AKT/mTOR signalling in pluripotency and cell fate determination. Development, 143, 3050-3060.
4. Martini M, et al. (2014). PI3K/AKT signaling pathway and cancer: an updated review. Ann Med, 46, 372-383.
5. Samuels Y, et al. (2004). High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science, 304, 554-554.
6. Madsen, et al. (2018). Cancer-associated PIK3CA mutations in overgrowth disorders. Trends Mol Med, 24, 856-870.

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