【PROTAC】新药开发系列（三） 降解雌、雄激素受体

上篇文章介绍了RaymondJ. Deshaies和CraigM. Crews等人在2001年的开创性工作。他们合理地利用与泛素连接酶E3体系SCF（Skp1-Cullin-Fbox）结合的10肽，加上甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP2）的共价抑制剂Ovalicin（天然产物），设计并合成了首个用于降解MetAP2的PROTAC-1。蛋白试验验证了PROTAC-1可快速降解MetAP2，且它与Ovalicin和10肽竞争性结合MetAP2和SCF。

图1 PROTAC通过SCF复合物Box泛素化降解ER和AR的机制

这个开创性的工作并没有就此结束，研究者提出了更进一步的问题。利用SCF的E3体系，是否可以设计不同的PROTAC用于降解其他致病蛋白？共价键蛋白抑制剂可以设计PROTAC，非共价键的天然底物能否用于设计PROTAC？PROTAC在蛋白水平试验有效，在细胞内是否也能产生同样的降解作用？

带着这些问题，研究者开始了新的PROTAC设计与验证。这次，他们选择了与前列腺癌相关的雄激素受体（AndrogenReceptor, AR）和与乳腺癌相关的雌激素受体（EstrogenReceptor,ER）作为降解的目标蛋白。很有意思是，这两个靶蛋白成为了后来Arvinas公司也是目前全球推进最快的PROTAC降解的蛋白。因此，2003年的这个研究是一个具有里程碑意义的工作。回顾一下上一篇里面提到的，研发最靠前的则是Arvinas公司的两个口服PROTAC（AVS-110，AVS-378），预计在2018年的10月份进入Ⅰ期临床试验，用于治疗耐雄激素限制疗法的前列腺癌和乳腺癌。

图2 Arvinas研发管线上的两个PROTAC药物

耐雄激素限制疗法的前列腺癌医学上叫去势抵抗性前列腺癌（CRPC）是指经过初次持续雄激素剥夺治疗（ADT）后疾病依然进展的前列腺癌。ADT包括最大限度雄激素阻断、药物去势、手术去势治疗。通过这种治疗方法通常可以抑制肿瘤的进展，但经过一段时间的治疗后，几乎所有的患者均发展为CRPC，一旦到CRPC就很容易发生前列腺癌的转移称为转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC），这是前列腺癌的主要致死因素，mCRPC患者平均中位生存时间仅12.3个月。被誉为癌症治疗新希望的免疫疗法目前对mCRPC一点办法也没有，二期临床实验（NCT02601014）表示CTLA-4／PD-1抗体对mCRPC没有很大的作用。目前，美国泌尿外科协会（AUA）、欧洲泌尿外科学会（EAU）等推荐的首选治疗药物是阿比特龙（雄激素合成抑制剂）和恩杂鲁胺（雄激素受体阻滞剂）。2015年LANCETONCOL报到对于疾病早期的未化疗mCRPC患者早期使用阿比特龙+波尼松治疗，能把患者的中位总体生存期提高到53.6个月。恩杂鲁胺2017年销售额为28.65亿元，位居全球抗肿瘤药物销售前20位，也可以见医生和患者对其效果的肯定。但遗憾的是2012年获FDA批准，到现在还没有进口，所以出现了比《我不是药神》更复杂的情况，只能买国外版的药品，希望国家药品进口政策的开放可以让恩杂鲁胺尽早进入我国，造福CRPC患者。

图3 降解ER和AR的两个PROTAC的合成路线

为了降解ER和AR，研究者分别利用了其天然底物（激动剂）雌二醇（Estradiol,E2）和二氢睾脂酮（Dihydroxytestosterone,DHT），通过中间的Linker连接IκBα磷酸化的10肽，设计了PROTAC-2和PROTAC-3。请注意，这次用来设计PROTAC的小分子为天然底物的激动剂，而非抑制剂，这说明设计PROTAC不一定非要选择抑制剂，激动剂也是可以滴，最重要的是特异性识别目标蛋白。从ER与E2和AR与DHT的蛋白晶体复合物结构来看，这两个分子都结合在受体蛋白的内部，完全被受体包裹。这非常有意思，Linker穿过了受体蛋白，制造出了空洞，这提示在设计PROTAC的时候，可以基于受体大胆的假设——没洞，我们可以打洞。不要让固定的结构限制了我们活跃的思想！

图4 E2与ER，DHT与AR的结合模式，橙色和蓝色圈为接Linker的地方

试验上，这次研究者采用了裂解293T细胞进行蛋白降解验证和显微注射293细胞观察降解效果。他们在论文中直接写出由于重组AR遇到问题，故只做了ER的细胞外蛋白实验。在后面的显微注射细胞内试验中，由于只有现成的含绿色荧光蛋白（GFP）AR的细胞，没有ER的，故他们只做了AR的降解试验。这样的方式，提示我们在科学研究中，试验不是一定非要全部做出来，合理的推导也是可以代替试验滴。

PROTAC-2降解ER的细胞外试验结果如图5，+表示添加了对应的物质，-表示没有添加，UbER表示泛素化的ER。UbER的产生对PROTAC-2有剂量依赖关系，如图5中A所示。PROTAC的确可以增加UbER，E2和IκBα磷酸化的10肽不能促进UbER的形成，且E2和IκBα磷酸化的10肽与PROTAC-2是竞争性的与ER结合，影响UbER的形成，如C、D、E所示。PROTAC-2特异性的降解ER，其它PROTAC不能诱导ER的泛素化，如F所示。

图5 Protac-2降解ER的细胞外试验结果

PROTAC-3降解AR的显微注射细胞内试验结果如图6，显微注射10uM浓度的PROTAC-3到293细胞（GFP-AR）后1小时，绿色荧光蛋白标记的AR蛋白完全消失，如A所示。重复试验总共注射了200多个细胞，每次30-50个，分4-6天完成。结果显示，有51%的细胞中的绿色荧光完全消失，29%的部分消失，16%的荧光降低较小，4%的荧光不消失，如B所示。C、D、E、F、G则是除了PROTAC-3外，还分别加入了IκBα磷酸化的10肽、睾酮、蛋白酶体抑制剂环氧酶素（epoxomicin）和PROTAC-2，结果观察到绿色荧光没有减弱或消失。细胞试验也验证了PROTAC-3的确是通过泛素化-蛋白酶体降解途径诱导AR降解，同时也从细胞层面验证了PROTAC-3降解AR的专一性。

图6 Protac-3显微注射293细胞后的AR-GFP降解试验结果

下一周，将和大家分享利用VonHippel-Lindau tumor suppressorprotein（VHL）泛素连接酶诱导降解雄激素受体（AR）的可透膜PROTAC设计，敬请关注。

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参考文献

1. Sakamoto,K. M.; Kim, K. B.; Verma, R.; Ransick, A.; Stein, B.; Crews, C. M.;Deshaies, R. J., Development of Protacs to target cancer-promotingproteins for ubiquitination and degradation. Mol Cell Proteomics 2003, 2 (12), 1350-8.

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