KRAS突变的结肠癌细胞中环状RNA下调并分泌至外泌体中
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11月28日，美国范德堡大学Zhang Bing团队在Nature子刊 Scientific Reports杂志在线发表了一项环状RNA的研究成果，报道在KRAS突变的结肠癌中环状RNA下调，并且发现这些环状RNA可进入外泌体（Dou et al., 2016）。
文中作者用到了三种结肠癌的细胞株：DLD-1，DKO-1和DKs-8。其中DLD-1同时携带了野生型和G13D突变的KRAS，DKO-1只有突变型的KRAS而DKs-8只有野生型。通过RNA-Seq，作者分析了这三种细胞中环状RNA的总体情况，发现相对于DKs-8，另两种细胞中的环状RNA的表达量总体呈现下降状态。作者进一步在另外两种结肠癌细胞系中验证了该结论，HCT116 为KRAS突变的细胞株而HKe3为KRAS不突变的细胞，测序结果表明HCT116的环状RNA表达总体低于HKe3。作者还发现结肠癌相关的环状RNA存在于外泌体中。
文中环状RNA如何分析的？
作者在本文中选择了不同KRAS突变状态的细胞株为研究对象，通过RNA-Seq实验分析他们环状RNA的差别。文中采用的分析策略基本参考了目前主流的RNA-seq分析环状RNA的流程，数据mapping的时候采用了多位点比对校准，有效降低了假阳性和假阴性。概括而言，首先将每个双端测序Read的两端分别进行基因组mapping，能够正确mapping的reads去除（属于正常剪切的产物），剩余的reads两端分别进行允许多位点mapping到基因组（multiple mapping），以确定它们的位置，再将其中正向跳跃式拼接的产物去除，得到反向拼接的Reads信息。最终再通过分析拼接位点是否符合GU/AG规则确定最终的环状RNA候选Reads。文中测序用的三个细胞株均作了两次的生物学重复。本文测序建库过程并未用RNase R消化处理。每个测序样本的测序通量大于100M数目的有效Reads。最终获得了1620种高可信度的环状RNA信息，其中1395种收录在CircBAse数据库中。作者也进行了RNase R消化后验证，在DKO-1 和 DKs-8细胞中RNA经过RNase R消化后验证了风度最高的前四种环状RNA，结果证明符合预期。
图1 环状RNA分析流程与主要结果 （来自(Dou et al., 2016)）
作者如何发现环状RNA表达量与KRAS突变的关系的？
作者选择了这三种细胞株很有代表性，分别代表了杂合和纯合型KRAS突变以及纯合野生型，这项研究中作者一开始的目的便是试图找出与KRAS突变状态对应的环状RNA表达特征。于是作者就分析了三种细胞株中环状RNA表达的总体差异状况，分析过程中发现了患者环状RNA表达量与KRAS突变有明显的对应关系：携带突变的KRAS的细胞环状RNA表达量明显低于野生型！于是作者就针对这一发现设计了后续的验证实验，形成了本文的故事。至于KRAS突变是否会影响个别环状RNA的表达状态，文中没有相关的描述。一个非常重要的问题是，作者是以什么作为参照分析出了KRAS突变的细胞中环状RNA表达下降的？高通量测序数据的分析中用到了同一种circRNA在不同细胞株中Reads数目进行比较分析，从总体的数据来看，KRAS突变的细胞中呈现明显的下调趋势。数据进行归一化处理采用的是EdgeR R package (version 3.6.8)，里面采用的normalization方法是Trimmed Mean of M-values，能很好的避免系统化的偏差。因此深度测序中分析到的circRNA表达整体下调是较严谨的结论。作者还进行了QPCR验证，挑选了几个有代表性的circRNA以GAPDH为内参，分析了三种细胞中表达情况，结果符合预期。
为进一步验证，作者又针对另一种KRAS突变细胞HCT116 及KRAS不突变的细胞株HKe3进行了验证实验，结果符合预期。表明KRAS突变后环状RNA表达下调是普遍现象。
图2 不同KRAS突变状态细胞中环状RNA表达比较 （来自(Dou et al., 2016)）
外泌体中存在环状RNA
之前已有报道表明外泌体中携带环状RNA，于是作者也分析了三种细胞培养基中外泌体环状RNA 的情况，分别进行了三次生物学重复。由于DKs-8细胞在三次重复实验中的变异最小，于是作者挑选这个细胞的数据进行分析。作者也挑选了有代表性的环状RNA在三种细胞株中进行验证，发现相对于DKs-8，在DLD-1的外泌体中circFAT1明显下调而circRTN4上调最明显，这些基因所对应的线性mRNA变化不明显。
由于建库的过程没有用RNase R消化，因此可以直接在测序结果中分析环状RNA与对应的线性RNA的比例。作者选择外显子所对应的环状RNA和线性RNA的Reads进行比较。外泌体的测序结果也进行了类似的分析。
图4 环状RNA与线性RNA表达比较（来自(Dou et al., 2016)）
本文的研究为结肠癌环状RNA研究提供了新的数据和思路。尤其是本文所发现的KRAS突变导致环状RNA总体表达下调的现象以及在外泌体中发现的环状RNA都为环状RNA研究提供了有价值的参考。
参考文献：
Dou, Y., Cha, D.J., Franklin, J.L., Higginbotham, J.N., Jeppesen, D.K., Weaver, A.M., Prasad, N., Levy, S., Coffey, R.J., Patton, J.G., et al. (2016). Circular RNAs are down-regulated in KRAS mutant colon cancer cells and can be transferred to exosomes. Sci Rep 6, 37982.
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