circ-Foxo3通过结合MDM2 和p53调控细胞凋亡敏感性

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11月25日，加拿大多伦多的Sunnybrook研究所健康科学中心的Burton B Yang教授和他的团队在Nature子刊Cell Death & Differentiation杂志在线发表了一项环状RNA的重要研究成果，报道circ-Foxo3可结合MDM2和p53，促进p53泛素化修饰和降解，稳定Foxo3蛋白，最终导致细胞PUMA上调并增加细胞凋亡敏感性(Du et al., 2016)。

circ-Foxo3在肿瘤细胞中表达下调

        作者首先利用乳腺癌和癌旁组织进行比较分析，表明癌组织中circ-Foxo3表达下调。接下来又在多种非肿瘤和肿瘤细胞株中比较了circ-Foxo3的表达情况，印证了这一结果。

图1 circ-Foxo3在肿瘤中表达下调。（来自(Du et al., 2016)）

诱导细胞凋亡的药物可刺激circ-Foxo3表达增高
        作者分析了双氧水，Doxorubicin和顺铂处理下circ-Foxo3的变化情况，结果表明这些细胞凋亡诱导药物均可明显提高circ-Foxo3的表达水平。

图2 双氧水，Doxorubicin和顺铂处理可上调circ-Foxo3（来自(Du et al., 2016)）

circ-Foxo3干扰后细胞的凋亡敏感性降低

        在将circ-Foxo3干扰之后细胞经过双氧水处理，细胞的增殖能力有所提高，凋亡比例下降。

图3 干扰circ-Foxo3可提高细胞增殖能力并降低凋亡比例 （来自(Du et al., 2016)）

过表达circ-Foxo3可抑制肿瘤生长，提高荷瘤小鼠存活率
        作者在肿瘤移植模型中过表达了circ-Foxo3，发现肿瘤生长速率变慢，荷瘤小鼠的存活时间延长。

图4 过表达circ-Foxo3可抑制肿瘤生长，提高荷瘤小鼠存活率 （来自(Du et al., 2016)）

过表达circ-Foxo3会影响p53，Foxo3及PUMA的表达量
        作者进一步探索了circ-Foxo3的分子机制。作者在实验中发现过表达circ-Foxo3会导致p53，Foxo3及PUMA的表达量改变。表现为p53下降，Foxo3和PUMA上升。

图5 过表达circ-Foxo3导致p53下降，Foxo3和PUMA上升 （来自(Du et al., 2016)）

circ-Foxo3与MDM2，p53，Foxo3及PUMA共定位
        借助荧光原位杂交与免疫荧光实验，作者分析了circ-Foxo3与MDM2，p53，Foxo3及PUMA的细胞定位，发现circ-Foxo3与这些蛋白均有共定位。

图6 circ-Foxo3与MDM2，p53，Foxo3及PUMA共定位（来自(Du et al., 2016)）

分子模拟结果表明circ-Foxo3与MDM2和p53存在相互作用
        作者首先用Mfold (version2.3)进行circ-Foxo3最小自由能状态的计算模拟，得到了该环状RNA的二级结构模拟分析信息。接着，作者用NPDock进行了docking分析，表明circ-Foxo3可以与MDM2和p53分子相互作用。

图7 Docking分析表明circ-Foxo3可以与MDM2和p53分子相互作用 （来自(Du et al., 2016)）

生化实验证实了circ-Foxo3与MDM2和p53的相互作用
        作者紧接着用生化实验技术验证了circ-Foxo3可以与MDM2和p53分子相互作用。作者首先用验证后的可以实现针对circ-Foxo3的干扰RNA分子进行生物素标记处理，利用该标记探针进行RNA Pull-down，表明该方法可以有效的结合circ-Foxo3，并用此探针成功检测到p53和MDM2。作者还用到了RNase A进行分析，当不含RNase A时，MDM2和p53均能分别钓取到对方，而当RNase A将circ-Foxo3消化后，MDM2和p53就不可以彼此钓取到了。这说明MDM2和p53是通过circ-Foxo3实现相互作用的。

图8 circ-Foxo3可以与MDM2和p53分子相互作用的生化试验验证 （来自(Du et al., 2016)）

Circ-Foxo3序列突变分析
        借助前述的circ-Foxo3与p53和MDM2结合位点的预测分析，作者针对circ-Foxo3与p53和MDM2相互作用的位点序列分别进行突变。结果证实了预测的序列与目标蛋白的结合。

图9 circ-Foxo3突变实验 （来自(Du et al., 2016)）

circ-Foxo3 影响p53 和Foxo3蛋白水平
        分别构建p53和MDM2的干扰RNA，作者分析了circ-Foxo3影响p53和MDM2及Foxo3蛋白水平的情况。结果表明circ-Foxo3可降低p53的含量但会增加Foxo3的含量，MDM2是造成这些变化状态的关键。

图10 circ-Foxo3 影响p53 和Foxo3蛋白水平（来自(Du et al., 2016)）

circ-Foxo3 通过影响MDM2对p53 和Foxo3的泛素化修饰水平调控后者的蛋白含量
        由于MDM2的功能是介导p53 和Foxo3的泛素化修饰，它们被泛素化后会被蛋白酶体降解。因此作者希望弄清楚circ-Foxo3是如何调控p53 和Foxo3的泛素化修饰状态的。通过IP实验等手段，作者最终证实circ-Foxo3通过同时结合MDM2和p53促进其泛素化降解，但由于circ-Foxo3不能结合Foxo3而只能结合MDM2，反而抑制了MDM2介导的Foxo3泛素化过程，因此导致Foxo3蛋白的富集。

图11 circ-Foxo3 通过影响MDM2对p53 和Foxo3的泛素化修饰水平调控后者的蛋白含量 （来自(Du et al., 2016)）

至此，circ-Foxo3如何影响肿瘤细胞的凋亡过程的基本机制就探索清楚了：circ-Foxo3可结合MDM2和p53，促进p53泛素化修饰和降解，稳定Foxo3蛋白，最终导致细胞PUMA上调并增加细胞凋亡敏感性。

本文针对circ-Foxo3的分子作用机制研究设计的非常严谨，为针对特定环状RNA功能研究工作提供了非常有价值的参考。

参考文献：

Du, W.W., Fang, L., Yang, W., Wu, N., Awan, F.M., Yang, Z., and Yang, B.B. (2016). Induction of tumor apoptosis through a circular RNA enhancing Foxo3 activity. Cell death and differentiation.

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