RIP实验方法

原创 2016-12-08 句月山人 circRNA

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2016年9月23日，意大利"ABT"-CNR遗传与生物物理研究所的Maria R. Matarazzo教授为通讯作者，在Methods in Molecular Biology杂志发表了RIP实验的操作方法(Gagliardi and Matarazzo, 2016)。本文为一篇Protocols，下面让我们一起学习一下RIP实验的操作方法：

材料与试剂准备：
（所有试剂均需用超纯水配制，试剂纯度级别不低于分析纯。）

PBS (pH7.4)；

10×多聚体裂解液：1000 mM KCl, 50 mM MgCl2, 100 mM HEPES-NaOH pH 7, 5% NP-40。室温放置，使用前用超纯水稀释至1×并添加1 mM DTT, 200 units/ml RNase OUT, EDTA-free蛋白酶抑制剂Cocktail。

5×NT-2 buffer：250 mM Tris-HCl(pH7.4), 750 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.25% NP-40。 4 °C保存。

NET-2 buffer：用超纯水将NT-2 buffer稀释至1×, 并添加20 mM EDTA (pH 8.0), 1 mM DTT, 200 units/ml RNase OUT。

甲醛溶液：50 mM HEPES-KOH, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 11 %甲醛。

细胞裂解液：10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM NaCl, 0.5 % NP-40。用时补加1mM DTT, 200 units/ml RNase OUT, EDTA-free蛋白酶抑制剂Cocktail。

核重悬Buffer：50 mM HEPES-NaOH (pH 7), 10 mM MgCl2。用前添加1mM DTT, 200 units/ml RNase OUT, EDTA-free蛋白酶抑制剂Cocktail。

IP Buffer：150 mM NaCl, 10 mM Tris–HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 8), 1 % Triton X-100, 0.5 % NP-40。用前添加1mM DTT, 200 units/ml RNase OUT, EDTA-free蛋白酶抑制剂Cocktail。

蛋白酶K消化Buffer：1× NT-2 buffer添加1 % SDS, 1.2 mg/ml Proteinase K。

操作流程：

图1 RIP实验操作流程（来自(Gagliardi and Matarazzo, 2016)）

常规RIP实验：
裂解物准备：

细胞生长至90%覆盖度，细胞计数，满足最终获得2~5mg蛋白样品的数量，约5~20 × 10 6细胞总数；
1000 ×g，4 °C离心5min，弃上清；
用1×预冷PBS洗两遍，弃上清；
用等体积的1×多聚体裂解液重悬细胞，轻轻吹散，冰浴5min；
-80 °C冻存促进细胞裂解，样品也可以在-80 °C放置数月。

磁珠与抗体准备：

protein-A/G包被的磁珠充分重悬，取75μl至1.5 ml EP管中；
NT-2 buffer洗涤两次；
用100μl NT-2 buffer重悬，加目标抗体5μg，室温混匀1h；
5000 × g离心15秒，加磁座吸附磁珠，上清用真空泵吸走；
从磁座上取下管子，加1ml NT-2，吹打混匀，5000 × g离心15秒，重复5次。（总共洗磁珠6次）；
900μl NET-2 buffer重悬磁珠，冰浴备用。

常规RIP：

将存放在-80 °C的细胞裂解物20000 × g，4 °C离心10 min；
取100μl上清至制备好的900μl NET-2 buffer重悬的磁珠中，进行抗体孵育，每个体系的体积为1ml；
取出10μl的样品作为“Input”备份，-80 °C保存备用；
垂直混合器4 °C混合3小时以上或过夜；
短暂离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置1min后弃上清；
加1ml NT-2，强力震荡混匀；
短暂离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置1min后弃上清，重复5次；
沉淀即为RIP实验获得的样品，可进一步通过蛋白酶K消化后提取RNA进行后续分析。

甲醛交联RIP实验：
裂解物准备：

细胞生长至90%覆盖度，细胞计数，满足最终获得2~5mg蛋白样品的数量，约5~20 × 10 6细胞总数；
向细胞悬液中加入适量的甲醛溶液，甲醛终浓度达到1%，室温放置10min；
向交联体系中加10倍体积的2.66 M甘氨酸，室温放置5min，冰浴10min；
用1×预冷PBS洗两遍，弃上清；
用4ml细胞裂解液重悬，冰浴裂解10-15min；
Dounce匀浆器的A杵匀浆10次，B杵匀浆40次；
1000g，4°C离心10min收集细胞核；
用3ml核重悬Buffer重悬，超声处理至DNA长度在1000~200bp范围；
加入250 unites/ml的DNase，37 °C孵育30min；
加入20 mM EDTA终止DNase；
样品重悬后通过添加相应试剂将Triton X-100浓度调至1%，脱氧胆酸钠浓度调至0.1 %，SDS浓度调至0.01 %，NaCl浓度调至140 mM，备用。

磁珠与抗体准备：

protein-A/G包被的磁珠充分重悬；
取75μl至1.5 ml EP管中，用0.5ml核重悬Buffer（添加1 % Triton X-100，0.1 %脱氧胆酸钠，0.01 % SDS和140 mM NaCl。）
用100 μl核重悬Buffer重悬磁珠，加5μg抗体或阴性对照，室温混匀1h；
5000 × g离心for 15 s，管子放到磁座上，弃上清；
加1ml核重悬Buffer，吹打混匀，5000 × g离心for 15 s，放到磁座上，弃上清，重复5次（总共洗6次）；
用75μl核重悬Buffer重悬，冰浴备用。

交联RIP：

将细胞裂解物20000 × g，4 °C离心10 min，吸取925μl体积的上清液至包被好抗体的磁珠中，终体积为1ml；
取出9.7μl的样品作为“Input”备份，-80 °C保存备用；
垂直混合器4 °C混合3小时以上或过夜；
短暂离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置1min后弃上清；
加1ml预冷的IP Buffer，强力震荡混匀；
短暂离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置1min后弃上清，重复5次；
沉淀即为RIP实验获得的样品，可进一步通过蛋白酶K消化后提取RNA进行后续分析。

RNA制备：

将RIP获得的样品加150 μl蛋白酶K Buffer，每个“Input”添加107μl of NT-2，15 μl 10 %SDS，18 μl蛋白酶K，总体积达到150 μl。55 °C孵育30min；
短暂离心将液体甩至管底。放置到磁座，上清转移至新的EP管中，加250 μl NT-2；
分别加入400μl酚:氯仿:异戊醇(125:24:1)，剧烈震荡15S，20000 × g室温离心10 min；
小心吸取350 μl上清，注意不要碰到沉淀层，上清转移至新的EP管中，加400μl氯仿，震荡15s，20,000 × g室温离心10 min；
小心吸取300 μl水相至新的EP管中，加50μl 5M的乙酸铵，15μl 7.5 M LiCl，5μl 的5 mg/ml糖原，850 μl无水乙醇；
−80 °C放置1h或过夜，20000 × g，4 °C 离心30 min，小心弃上清；
500 μl预冷的80%乙醇洗涤沉淀，20000 × g，4 °C离心15 min；
样品晾干，用10~20 μl的RNase-free水溶解RNA样品。可以增加DNase处理步骤以排除DNA污染造成的干扰。
所收取的RNA样品可直接用于反转录鉴定，QPCR，microarray，测序等后续研究。

注意事项：

所有的实验用品均需保证无DNase和RNase，操作台面和移液枪等实验用品保证绝对干净；
细胞裂解过程中适当震荡有利于细胞充分裂解；
IP用磁珠的选择要严格遵照说明书。一般小鼠来源的抗体与Protein G结合力较强，兔来源的抗体与蛋白A/G结合力均较强；
磁座吸附磁珠的时候要注意注意磁珠需完全附着在管壁，弃上清的过程要注意更换枪头；
存在于NET-2的EDTA能降低核糖体RNA与核糖体蛋白的结合，需要注意实验的需要；
Input对照可用于QPCR的标准曲线。更严谨的设计里还需要有非特异性结合RNA的对照，需要慎重的选择合适非目标蛋白进行非特异性结合的对照，如果是非RNA结合蛋白有可能会大大降低非特异性结合RNA的能力，并不是最佳的非特异性RNA结合对照。
IP效率需要要通过Western实验验证，因此需要准备更多量的input对照；
为了提高交联的效率，在收集完细胞并计数后最好用预冷PBS洗涤两次，甲醛交联的反应也最好在预冷PBS溶液中进行。甲醛交联的时间非常重要，太短了会造成假阴性，太长了则造成假阳性。需要设计实验逐渐摸索条件。
超声处理的条件也非常关键。超声处理的效果受到细胞类型，细胞密度与数量等条件的影响。超声处理中需要冰浴以减少蛋白变性的可能，超声的强度宜选择中等强度条件，分多次脉冲式处理更好。