2020开门红！Cancer Cell报道黑色素瘤中CDR1as功能机制

CDR1as是最早报道功能机制的circRNA分子，也是目前唯一实现CNS大满贯的circRNA分子。1月13日，Cancer Cell杂志报道了CDR1as在黑色素瘤中的功能机制研究，表明黑色素瘤中CDR1as是由LINC00632基因的转录产物加工形成的，可以被EZH2/PRC2沉默表达。CDR1as可结合IGF2BP3，CDR1as表达降低后可释放IGF2BP3，改变一些靶基因的表达状态，参与黑色素瘤的迁移侵袭及GPX4药物敏感性（[1]）。

CDR1as研究的主要进展：

2013年，两篇Nature报道CDR1as可竞争性结合miR-7，最早证明了circRNA具有miRNA Sponge的功能（[2, 3]）。miRNA Sponge功能模型也成为目前报道最多的circRNA功能模型。

2017年，Sicence报道敲除CDR1as小鼠大脑神经突触间信号传递异常（[4]）（推荐阅读：重磅！Science在线发表circRNA研究论文）

2018年，Cell文章报道人类大脑中RNA间相互作用的网络，报道了四种非编码RNA“相生相克”的精彩故事（[5]）

2019年，Cell报道心脏翻译组学研究，其中发现CDR1as可以结合在核糖体测序中被捕获，提示该分子也可能被翻译（[6]）。（推荐阅读：Cell：心脏翻译组学文章，证明circRNA可翻译）

截至目前，CDR1as的研究论文和综述已经多达85篇，是研究报道最多的circRNA分子。

在本文中，作者发现黑色素瘤中CDR1as表达沉默与肿瘤的浸润侵袭状态有关，因此深入分析了黑色素瘤中CDR1as生成，表达，调控，功能方面的机制。作者发现CDR1as的表达与上游非编码RNA基因LINC00632密切相关，并证实了CDR1as的表达是受到LINC00632表达变化而影响的。随着黑色素瘤的进展，CDR1as表达会呈现下降趋势，EZH2/PRC2介导了LINC00632/CDR1as Locus的表达沉默。在黑色素瘤中miR-7不是CDR1as影响侵袭迁移能力的原因，分析表明IGF2BP3的结合与这些现象有关。本文从RNA结合蛋白入手分析了CDR1as 与黑色素瘤侵袭能力的关系，并基于多种在线数据和信息分析了相关的基因和通路，药物敏感性等。下面就让我们一起学习一下本文：（声明：为了清楚的表达文章的故事，有些内容与原文的顺序有所区别，敬请谅解）

CDR1as在黑色素瘤中的功能是怎样的？

作者分析了4例黑色素细胞和10例短培养黑色素瘤细胞（melanoma short-term cultures，STCs）的RNA-seq数据，分析了其中的circRNA表达情况。从测序数据中，作者分析了环状RNA与来源基因的线性RNA表达的比值，发现CDR1as的成环比例比预期的要低。10例STCs中6例检测不到CDR1as，作者发现另外的4例是从黑色素瘤脑转移的病灶分离的，怀疑是由于分离的标本中掺杂了胶质细胞的缘故。黑色素瘤的细胞系中CDR1as的表达也不高。进一步分析表明相对于初发的患者，高转移侵袭的黑色素瘤标本中CDR1as的表达显著降低。生存分析表明，CDR1as表达最低的25%患者生存情况明显比其余75%的患者要差。综合这些现象，CDR1as在黑色素瘤中表达如何调控的，它的功能和机制等问题就非常值得深入探讨。

图1 黑色素瘤中CDR1as表达下调，与肿瘤侵袭有关 （[1]）

为进一步证明CDR1as在黑色素瘤迁移侵袭中的作用，作者构建了Dox诱导表达靶向CDR1as的shRNA分子的模型，结果显示在低侵袭性高表达CDR1as的黑色素瘤细胞系（WM278和WM115）中干扰CDR1as并不能显著影响细胞增殖，但可以显著提高细胞侵袭能力。在低表达LINC00632/CDR1as的细胞（SK-MEL-28 和 501MEL）中，干扰CDR1as对侵袭表型没有影响。SK-MEL-28 和 501MEL细胞中过表达CDR1as能降低侵袭性，体内成瘤实验表明，干扰CDR1as并不显著改变肿瘤大小和生长速度，但可以显著体提高肺转移比例。

图2 CDR1as降低可促进黑色素瘤转移侵袭能力 （[1]）

黑色素瘤中CDR1as的生成是如何调控的？

早期曾有报道发现CDR1as是在一个非编码RNA LINC00632的基因内部。本文作者进一步验证了这个假设，并证明CDR1as的表达的确与LINC00632高度相关。多种在线数据的统计结果均表明CDR1as的表达与LINC00632高度相关（相关系数r=0.86, p<0.0001），这些数据包括TCGA，GTEx，mouse neural crest-derived tissues。作者还从测序数据和PCR验证实验找到了LINC00632来源的两个转录本（ENST00000498732和ENST00000602535）包含了CDR1as序列，证明了CDR1as从LINC00632的产物中形成。Cas9破坏3’剪切位点可显著减少CDR1as的生成比例，但同时增加了 LINC00632的生成比例。SAM CRISPR/Cas9技术增强LINC00632的表达也会同步提高CDR1as的数目。这些数据均佐证了之前报道的CDR1as来源于非编码RNA基因LINC00632。

miR-671-5p可通过RNAi机制促进CDR1as的降解，但还没有报道表明LINC00632是miR-671-5p的作用底物，因此作者分析了黑色素瘤组织和细胞中三者的表达关系，结果表明在病人组织中miR-671-5p的表达与CDR1as的表达仅有微弱的相关性，但细胞中的表达没有相关性。过表达miR-671-5p可降低CDR1as的表达，但不影响LINC00632的表达，而敲降miR-671-5p并不能使得CDR1as表达值回复。综上现象，黑色素瘤中CDR1as的表达似乎并非由miR-671-5p的调控实现，更可能是由于CDR1as的来源基因LINC00632表达的影响造成的。

在线数据分析表明黑色素瘤中LINC00632基因区域（包括CDR1as在内）并不存在典型的删除突变，但H3K27me3和H3K27ac的ChIP结果强烈提示LINC00632基因区域在黑色素瘤中存在较强的染色体关闭信号。EZH2 抑制剂GSK126处理后可明显恢复LINC00632和CDR1as的表达。这表明黑色素瘤中LINC00632/CDR1as的表达是受到EZH2/PRC2的调控。

图3 LINC00632/CDR1as的表达是受到EZH2/PRC2的调控 （[1]）

如何探讨黑色素瘤中CDR1as与miR-7的关系？

CDR1as是最早报道功能机制的circRNA分子，竞争性结合miR-7是最有代表性的miRNA sponge模型（[2,3]），但CDR1as敲除的模型中也显示，在脑组织中CDR1as还具有稳定miR-7的作用（[5]）。在黑色素瘤中CDR1as与miR-7的关系是怎样的呢？

干扰CDR1as并不影响miR-7-5p的表达，也不会对miR-7结合位点荧光素酶报告基因产生影响，一些miR-7的下游基因也没有受到影响。Cas-9敲除miR-7-1可显著抑制miR-7表达，但不会改变细胞侵袭能力，反而在敲除miR-7-1的基础上干扰CDR1as可提高细胞侵袭能力。这说明黑色素瘤中敲降CDR1as导致的侵袭能力增强并非由miR-7介导。

图 4 黑色素瘤中敲降CDR1as导致的侵袭能力增强并非由miR-7介导 （[1]）

黑色素瘤中CDR1as与IGF2BP3结合的作用机制

为揭示CDR1as在黑色素瘤中的作用机制，作者首先思考了CDR1as可能的相互作用蛋白。与传统思路不同，作者首先从CLIP-seq的在线数据中分析了可能的结合蛋白，并从中发现了IGF2BP家族蛋白存在与CDR1as相互作用的证据。为进一步验证，作者进行了RIP分析，发现IGF2BP3对CDR1as的富集作用最强，并且对LINC00632的结合不高，说明IGF2BP3具有特异性结合CDR1as的作用。干扰IGF2BP3可降低由于干扰CDR1as导致的侵袭增强现象。IGF2BP3的RIP-seq能很强的富集CDR1as，作者在黑色素瘤中的数据与已发表的IGF2BP3的RIP-seq或CLIP-seq数据有20~40%的重叠。CDR1as序列中存在大量的IGF2BP3结合位点。

CDR1as干扰前后IGF2BP3结合的靶分子种类没有太明显的改变，但CDR1as干扰后变化显著的基因更倾向于富集到IGF2BP3结合的靶分子列表中。为进一步分析这些基因对CDR1as敲降后促进侵袭的表型的关系，作者进行了小规模RNA干扰文库的分析，针对CDR1as干扰后表达会增高的9种基因进行RNAi文库分析，其中6 种基因能显著逆转因干扰CDR1as导致的侵袭增加。其中SNAI2 和MEF2C在CDR1as干扰后的表达增高是由IGF2BP3介导的。

图5 IGF2BP3结合CDR1as，与CDR1as干扰后促进侵袭的表型有关 （[1]）

最后，为分析CDR1as表达状态与黑色素瘤中药物敏感性和基因型的相关性，作者在Depmap和CTRP的数据中进行了挖掘，并结合CCLE的数据对所有相关细胞中CDR1as表达状态进行了分组，分为高表达，中表达和低表达三组。有趣的是，作者发现低表达CDR1as 组的细胞对多种MAPK通路的抑制剂更敏感。但在CDR1as高表达的细胞中敲低CDR1as并不能增加细胞对BRAF抑制剂（Dabrafenib）的敏感性。CDR1as表达值与BRAF突变的关系分析表明CDR1as低表达的细胞更高比例携带了BRAF突变。有趣的是，高表达CDR1as的细胞对GPX4抑制剂更敏感。sgRNA文库数据分析也表明，GPX4在CDR1as高表达的细胞系中富集显著高于CDR1as低表达组。黑色素瘤中GPX4抑制剂的敏感性与MITF / AXL基因的表达有关，MITF低表达且AXL高表达的细胞对GPX4抑制剂更敏感，但对MAPK抑制剂等药物不敏感。作者分析发现CDR1as高表达的细胞倾向于表现出MITF低表达和AXL高表达，而CDR1as低表达的细胞倾向于表现出MITF高表达和AXL低表达。实验结果也表明CDR1as表达状态与GPX4抑制剂敏感性有相关性，低表达CDR1as组的细胞对GPX4抑制剂更敏感。然而在高表达CDR1as的细胞中干扰CDR1as后并不能提高对GPX4的敏感性，说明CDR1as可作为黑色素瘤对GPX4抑制剂敏感性的指标，但并非该药物发挥功能的关键因素。

图6 CDR1as表达对应于MITF / AXL表达状态，与GPX4抑制剂敏感性有关 （[1]）

本文的发现报道了CDR1as通过结合蛋白调控重要生理活动的机制，大大提高了对CDR1as的功能机制的认知。文章有很多值得学习的技术和思路，概括而言包括以下几点：

（1）在线资源的有效整合可帮助预测分析和设计相关实验。文中多次运用了在线数据资源，包括TCGA，GTEx，CLIP-seq，ChIP-seq以及后面分析药物敏感性和基因突变信息中用到的Depmap，CTRP的数据以及CCLE的数据。这些在线数据能大大提高研究思路和方向设计的效率，从已有数据中挖掘可能的机制和方向。这种做法非常值得学习，也越来越多的用到。

（2）RNA结合蛋白是突破circRNA研究机制单一性的重要思路。CDR1as是最早也是最有影响力的miRNA Sponge模型分子。但本文的实验分析过程中却发现miR-7对作者分析的模型并没有作用，因此提示存在其他的作用机制。生物体本来就是复杂和多维度的，从不同角度发现和认识生物分子的功能是非常必要的。

（3）高通量文库在探索功能性分子中的价值。本文并没有从一开始就利用高通量文库进行筛选分析，但在后面探索CDR1as下游基因与侵袭迁移表型及IGF2BP3结合作用之间的关系时用到了一个只有几个分子的RNAi文库体系，用于评价这些基因在相关通路中的作用。后面的Depmap数据则是高通量的RNAi和sgRNA文库体系的结果，间接的为本文最终的结论提供了帮助。

参考文献

1. Douglas H., et al., Epigenetic Silencing of CDR1as Drives IGF2BP3-Mediated Melanoma Invasion and Metastasis. Cancer Cell, 2020. 37(1): p. 55-70.

2. Memczak, S., et al., Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature, 2013. 495(7441): p. 333-8.

3. Hansen, T.B., et al., Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature, 2013. 495(7441): p. 384-8.

4. Piwecka, M., et al., Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science, 2017. 357(6357).

5. Kleaveland, B., et al., A Network of Noncoding Regulatory RNAs Acts in the Mammalian Brain. Cell, 2018. 174(2): p. 350-362 e17.

6. van Heesch, S., et al., The Translational Landscape of the Human Heart. Cell, 2019. 178(1): p. 242-260 e29.

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