深度长文『上』|2019年度circRNA研究盘点

值此元旦佳节之际，山人首先祝各位身体健康，工作顺利。刚刚过去的2019年，circRNA研究继续保持快速发展。中国科学院与科睿唯安联合发布的《2019研究前沿》中，“环状RNA作为癌症新的生物标志物”成为生物科学领域6个新兴前沿之一，这也是环状RNA作为关键词连续三年进入《研究前沿》报告的名单。2019年共发表circRNA相关SCI论文885篇，较2018年增长20%，其中大于10分的文章多达58篇，是2018年的3倍！呈现量质齐升的良好态势。国家自然科学基金项目总数维持稳定，说明国内circRNA研究团队数目增速有所放缓。下面让我们一起回顾一下2019年circRNA研究的总体情况和几个主要方向的详细情况：

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2019年circRNA研究总体情况概览

1.1 circRNA相关发表文章情况汇总

2019年circRNA研究论文呈现量质齐升的良好态势，发表论文总数量较2018年有较大的增长，尤其是影响因子大于10 的文章数目更是有了巨大的增长。发表文章的通讯作者单位情况来看，我国是circRNA研究的绝对主力阵地，但2019年美国，德国，加拿大等传统生物医学研究强国也陆续发表了一些有重要影响的研究论文，说明circRNA的研究已经慢慢被国际学术界接受和认可，也预示着将来circRNA会有更多重要的研究成果。

图1 2016-2019年circRNA相关发表文章信息汇总

1.2 circRNA相关国家自然科学基金情况汇总

2019年circRNA研究领域共有257个项目获批，其中包括杰出青年基金项目1项，重点项目2项，创新研究群体项目1项，面上项目113项，地区基金项目24项，青年科学基金项目116项。

表1 2016-2019年国家自然科学基金circRNA相关项目信息汇总

2019年获批项目绝大部分的内容是针对特定circRNA的功能研究，大部分都给出了明确的机制和通路，表明circRNA的功能研究已进入全新的阶段。总体呈现的一些特征如下： 

（1）学科方向方面，医学领域依然具有压倒性优势，动物学、植物学以及生物信息学方向也有获批的项目。但生物化学和分子生物学，细胞生物学，遗传学，干细胞与再生医学等学科方向的项目偏少。可能与circRNA基础生命科学问题的研究难度有一定关系。

（2）研究内容更加明确和具体。2019年获批的项目从题目中不难看出，大部分都是基于某个特定circRNA分子和特定的通路和机制来写的，说明申请者已对相关分子的功能和作用机制有了较详细的认知。这也说明circRNA的功能和机制的研究已经越来越细致和深入。

（3）circRNA的功能机制模型和通路呈现多样化趋势。2019年获批的项目中除了传统的竞争性结合miRNA功能模式，circRNA直接翻译多肽，与蛋白的相互作用以及circRNA的m6A修饰等功能模型相关的项目越来越多。此外，近几年热度较高的分子细胞生物学机制和通路也在今年获批的cirRNA项目中多次出现，包括m6A修饰、外泌体、细胞焦亡、相分离、铁死亡等等。说明circRNA的研究正越来越融入分子细胞生物学研究中。

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circRNA基本生命科学问题研究进展

circRNA早在1976年就发现了，但真正的研究热潮是从2012年开始的，主要是伴随着高通量测序技术的广泛应用而逐渐兴起的。目前人类组织来源的circRNA已经发现了几十万种，但关于它们的表达机制，功能作用方式，修饰及其调控方式，二级/高级结构，降解机制等基本生命科学问题的研究和认识还在持续进展中。2019年关于circRNA的生成机制，m6A修饰，翻译产物，互作分子，降解机制方面有一些进展，有关circRNA的特殊生物学功能机制研究也有一些报道，现分别汇总如下：

2.1 circRNA生成机制研究进展

2019年关于circRNA生成和表达机制有一些进展，包括通过解析酵母剪切体E复合体的结构，揭示了反向剪切的结构生物学机制，发现了几种能调控circRNA生成的特殊RNA结合蛋白，首次报道人类线粒体来源circRNA等等。

酵母剪切体E复合体结构揭示circRNA形成机制

2019年9月6日，Nature杂志发表了一项酵母剪切体E复合体的结构生物学研究成果，揭示了E复合体的组装机制，首次从结构生物学角度证明了“Intro-definition”和“Exon- definition”两种E复合体组装的机制均可存在。基于这一结构作者分析了长外显子circRNA的形成机制，外显子足够长的情况下，EDC复合体可以介导pre-mRNA内部反向剪切，最终形成circRNA。论文的通讯作者是美国科罗拉多大学安舒茨医学校区的Rui Zhao和加州大学洛杉矶分校的Z. Hong Zhou（[1]）。

图2 剪切体E复合体介导pre-mRNA和circRNA剪切的机制 （[1]）

调控circRNA生成的RNA结合蛋白

RNA结合蛋白（RBP）是调控circRNA生成的重要因素，很可能是circRNA组织/疾病特异性表达的主要机制。人们一直在不断探索和发现可调控circRNA生成的RBP蛋白，2019年共有5篇文章涉及到RBP调控circRNA生成的研究，具体信息汇总如下：

表2 2019年报道调控circRNA生成的RBP

哺乳动物的散在重复元件（MIR）调控 circRNA的生成

2019年6月4日，知名预印本杂志BioRxiv发表一项circRNA生成机制有关的研究成果，报道发现CDR1as也可以由哺乳动物的散在重复元件（Mammalian-Wide Interspersed Repeats，MIR）介导生成（[2]）。文章的通讯作者是日本藤田健康大学的Akila Mayeda。

图3 MIR调控CDR1as的生成 （[2]）

2.2 特殊类型circRNA的发现

常见的circRNA主要由mRNA的外显子通过反向剪切形成，但还有一些circRNA来源比较特殊，比如融合基因形成的circRNA等等。2019年陆续报道了一些新的circRNA形式，包括融合基因来源的circRNA，转录通读型circRNA，线粒体DNA来源circRNA。

融合基因来源circRNA研究

融合基因是很多肿瘤的驱动因素，如白血病，肺癌等等。早在2016年就曾报道融合基因来源的circRNA具有致癌作用（推荐阅读：cell杂志 | 融合环状RNA文献解读）。四川大学彭勇教授2018年也曾报道肺癌中EML4-ALK融合基因来源的circRNA（F-circrEA）可以作为肺癌诊断标志物（推荐阅读：新型融合基因来源环形RNA可能作为肺癌诊断标志物）。2019年，彭勇教授再次发表文章报道融合基因来源circRNA，报道SLC34A2-ROS1来源的circRNA（F-circrSR1和F-circrSR2）可促进肺癌侵袭（[3]），相关工作发表于5月24日的Molecular Cancer杂志。

图4 SLC34A2-ROS1融合基因来源circRNA鉴定 （[3]）

转录通读型circRNA

常见的基因转录活动在基因全序列被完全转录完成后终止，但在一些特殊情况下，转录过程还会继续往下进行，如果下游刚好在DNA的同一链上也有个基因，就会产生同一个转录本携带两个基因的形式，这就是转录通读（Read Through）。2017年就曾有文章报道转录通读过程与circRNA的形成有关（推荐阅读：重磅！Molecular Cell杂志发表circRNA形成机制的重要文章），当时发现干扰调控转录终止的基因可有助于转录通读产物的生成，并且可促进下游基因来源circRNA的生成（[4]）。

2019年2月7日的一篇Cell文章在全外显子组芯片数据中挖掘得到了大量的circRNA，其中也有转录通读型的circRNA产物（rt-circRNA）。文章分析了超过2000例不同组织来源的人类肿瘤标本，二十多种肿瘤中circRNA的总体表达情况，并汇总形成了MiOncoCirc数据库（[5]）。文章通讯作者为密歇根大学Alexey I. Nesvizhskii和Arul M. Chinnaiyan。

图5 人类肿瘤中存在转录通读型circRNA（[5]）

首次报道线粒体编码基因来源circRNA

2019年6月12日，预印本杂志BioRxiv发表了中国科学技术大学单革教授的一项研究成果，报道发现人与小鼠线粒体来源的circRNA（mecciRNAs）。这是首次报道发现哺乳动物线粒体来源的circRNA分子，丰富了circRNA的来源和认识（[6]）。

图6 mecciRNAs鉴定 （[6]）

2.3 circRNA的m6A修饰研究进展

转录后修饰是RNA功能调控的一个维度，以m6A为代表的RNA修饰方式和调控机制的研究是近期RNA研究领域的重要热点方向之一。早在2016年就曾报道发现了circRNA存在特异性的m6A修饰（推荐阅读：重大发现：circRNA存在细胞特异性的m6A修饰！），并且介导了circRNA的翻译（推荐阅读：重磅：m6A修饰促进环状RNA的翻译）。

2019年circRNA的m6A修饰取得了不少进展，包括m6A修饰相关的circRNA降解机制，m6A修饰介导的circRNA出核现象，m6A修饰在细胞中区分内源和外源circRNA的机制等等。circRNA降解在下面有专门的内容介绍，细胞区分内源和外源circRNA的机制也在后面有专门的探讨，因此本部分主要介绍其他的内容：

m6A修饰介导circRNA出核

2019年10月16日，Nature Communications杂志在线发表了发表了一项circRNA m6A修饰的文章，报道发现m6A修饰的circNSUN2可结合YTHDC1并促进出核，进一步结合IGF2BP2促进HMGA2 mRNA的稳定，最终促进大肠癌的肝转移增强。文章的通讯作者是中山大学附属肿瘤医院谢丹教授，徐瑞华教授和Wang Fengwei。本文从小样本临床标本的分析入手，找到CRC肝转移相关的circRNA分子，然后基于RNA Pull-down分析，发现了circNSUN2的相互作用蛋白YTHDC1和IGF2BP2，进而从干扰circNSUN2前后转录组差异分析结合作者所发现的现象找到HMGA2 mRNA是circNSUN2促进CRC肝转移的介导分子（[7]）。

图7 m6A修饰促进circNSUN2出核介导CRC肝转移 （[7]）

大鼠缺氧性肺动脉高压模型中m6A修饰研究

2019年5月1日，预印本杂志BioRxiv发表了浙江大学医学院应可净和章锐锋为通讯作者的文章，报道大鼠缺氧性肺动脉高压（HPH）模型中。circRNA m6A修饰状态的研究结果（[8]）。文章的结果表明一些circRNA的m6A修饰会伴随缺氧条件而发生修饰或去修饰的改变，说明m6A修饰与缺氧条件有密切的关系。

图8 大鼠HPH 模型中circRNA m6A修饰分析（[8]）

2.4 circRNA翻译研究进展

自2017年首次报道哺乳动物内源circRNA可以翻译多肽/蛋白以来，有关circRNA翻译的研究就一直备受关注。2019年circRNA的翻译研究也取得了一些进展，包括心脏翻译组学的研究中发现了可翻译的circRNA分子，Akt3，β-catenin等基因来源circRNA的翻译产物鉴定和研究。

心脏翻译组学研究发现可翻译circRNA

2019年5月30日，Cell杂志以Resource形式发表了一项心脏翻译组学的研究工作，系统分析了心脏组织中能被翻译的RNA分子，心脏中RNA翻译的规律和机制，研究中发现了一些非编码RNA来源的翻译产物，其中包括circRNA。文章通讯作者是德国柏林Max Delbruck分子医学中心Sebastiaan van Heesch和Norbert Hubner。本文作者分析了80例人心脏组织的翻译组学（其中65例扩张型心肌病，15例健康对照），发现了心脏组织特异的蛋白翻译机制。在捕获的可翻译的RNA分子中发现了169种lncRNA，40种circRNA，进一步佐证了非编码RNA，包括circRNA能被翻译的事实（[9]）。

图9 心脏翻译组学研究 （[9]）

2019年还有另外一篇翻译组学的研究工作发现了一些可能翻译的circRNA分子。12月20日，cells杂志发表了一项在分化型神经母细胞瘤中进行的circRNA表达谱分析，作者也进行了核糖体测序分析，在Ribo-seq的结果中共发现了173种可能被翻译的circRNA分子（[10]）。

Circ-AKT3编码174aa的多肽

2019年8月30日，Molecular Cancer杂志在线发表了中山大学附属第一医院张弩副教授的最新研究成果，报道发现AKT3来源的一个circRNA（Circ-AKT3）可编码一种174aa的多肽（AKT3-174aa）。在GBM细胞中过表达AKT3-174aa可抑制细胞增殖，抗辐射和体内致瘤能力，而敲低circ-AKT3后则增强了星形细胞瘤细胞的恶性表型。机制研究表明，AKT3-174aa与磷酸化PDK1竞争性相互作用，减少AKT-thr308磷酸化，并在调节PI3K/AKT信号强度中起负调节作用（[11]）。

图10 Circ-AKT3编码一个174aa的蛋白（[11]）

circPPP1R12A翻译多肽通过Hippo-YAP 通路调控结肠癌侵袭

2019年3月29日，Molecular Cancer杂志在线发表了苏州大学附属第三医院蒋敬庭为通讯作者的文章，报道发现circPPP1R12A在结肠癌中显著高表达，进一步的研究发现circPPP1R12A可以编码一种73aa的小肽（circPPP1R12A-73aa），circPPP1R12A-73aa可以通过Hippo-YAP 通路参与结肠癌的转移侵袭（[12]）。

图11 circPPP1R12A编码一种73aa的小肽 （[12]）

β-catenin来源circRNA翻译产物通过激活Wnt途径促进肝癌细胞生长

2019年4月26日，Genome Biology杂志发表了一项circRNA翻译产物的研究工作，报道发现circβ-catenin可翻译一种370aa的蛋白，可通过竞争性抑制GSK3β，阻断GSK3β对全长β-catenin的磷酸化和随后的泛素化降解（[13]）。文章的通讯作者为广州中医药大学第一附属医院的Jin-Fang Zhang、南方医科大学药学院的Wei-Ming Fu和中山大学附属第三医院的张琪。

图12 circ β-catenin翻译新蛋白鉴定 （[13]）

HPV编码circRNA翻译产物助纣为虐

2019年5月24日，Nature communications在线发表了一项HPV来源circRNA翻译产物致病性作用机制的研究。文章发现HPV16来源的circE7携带了完整的E7基因ORF序列，并证明circE7可翻译出对应的蛋白，可促进子宫颈癌细胞发生转化（[14]）。文章的通讯作者是来自美国德克萨斯大学西南医学中心皮肤科的Richard C. Wang和芝加哥西北大学Feinberg医学院微生物免疫学系的Laimonis Laimins。

图13 HPV16来源circE7编码产物鉴定 （[14]）

circRNA翻译起始机制研究

2019年9月25日，预印本杂志BioRxiv发表了中科院计算生物学研究所王泽峰教授为通讯作者的一项研究工作，通过设计随机序列后筛选的技术，分析了circRNA中IRES-like元件。共筛选到97种可以在circRNA中驱动翻译的富含AU的IRES-like元件（[15]）。

图14 circRNA中具有IRES-like功能的序列元件分析 （[15]）

2.5 circRNA相互作用分子研究

分子间相互作用是生物分子发挥功能的重要方式，circRNA很多功能也是基于与其他分子的相互作用实现的，典型的包括竞争性结合miRNA的“miRNA Sponge”模型，与蛋白相互作用。2019年circRNA的研究的深度比此前有了很大的进步，绝大部分涉及到特定circRNA的研究都对其功能机制进行了分析。结合miRNA和结合蛋白的研究工作数量都非常大，下面主要选取最有代表性的研究工作进行介绍：

circRNA结合miRNA的研究

2019年4月26日，Cell杂志发表了加拿大多伦多大学Paul C. Boutros教授和Housheng Hansen He教授为共同通讯作者的circRNA研究工作，通过大样本测序和高通量shRNA文库筛选对局限性前列腺癌生长必须的circRNA （essential circRNA）。这项工作是首次利用高通量shRNA文库筛选功能性circRNA分子，这部分将在后面详细探讨。作者一共获得了171种局限性前列腺癌的essential circRNA。作者选择circCSNK1G3进行进一步的分析，作者发现circCSNK1G3可以竞争性结合miR-181b/d。他们的数据表明circCSNK1G3与miR-181b/d的表达数量大致在相同的水平（表达量相差太悬殊不能很好的起到竞争性结合抑制的作用）。RIP和RNA pull-down实验证明circCSNK1G3可以结合miR-181b/d。干扰circCSNK1G3和过表达miR-181b/d后对CBX7，CDK1和CDC25A（miR-181b/d的靶基因）表达的影响相反。干扰circCSNK1G3后过表达miR-181b/d反而促进增殖，这说明circCSNK1G3结合miR-181b/d后并没有抑制miR-181b/d的活性，而降低circCSNK1G3则导致miR-181b/d无法抑制靶基因的表达（[16]）。这一结果表明circRNA与miRNA的结合并不仅仅通过抑制miRNA的功能这一种途径发挥作用，还存在其他作用机制。

图15 circCSNK1G3结合miR-181b/d （[16]）

circRNA结合蛋白研究

circRNA结合蛋白是另一种基于相互作用发挥功能的机制模型。2019年这方面也报道了很多重要的发现，包括circACC1与AMPK酶的结合，circYAP拮抗其YAP蛋白翻译过程等等。

2019年5月30日，Cell Metabolism杂志发表了一篇circRNA的研究论文，报道发现circACC1可以与AMPK的β和γ亚基相互作用，并促进AMPK的稳定性，同时参与维持AMPK基础活性。文章的通讯作者是中国科学技术大学的吴缅教授和安徽医科大学的胡汪来教授。文章先从筛选脂代谢相关基因来源的circRNA是否与脂代谢相关入手，找到了circACC1分子，然后进一步确认了circACC1与脂代谢的相关性，进一步分析了ACC1，AMPK等代谢酶和调控基因的表达和磷酸化状态和表达水平，发现了干扰circACC1能够降低ACC1，FPKFB3的磷酸化水平，同时也降低AMPK磷酸化水平及亚基的丰度。这些发现暗示了circACC1可能与AMPK的功能有关系，相互作用分析确认了circACC1与AMPK的β和γ亚基可直接相互作用，突变分析找出了它们相互作用的区段。作者还发现了血清饥饿可通过c-Jun激活circACC1的表达。最后肿瘤学功能分析表明circACC1具有促进肿瘤生长的作用，病人标本中也存在较高比例的circACC1高表达情况（[17]）。

图16 circACC1与AMPK β和γ亚基相互作用 （[17]）

2019年5月15日，加拿大多伦多大学杨柏华教授团队首次报道发现YAP基因来源的circRNA可拮抗YAP的mRNA翻译起始过程，调控其母基因的翻译效率。YAP是Hippo通路的关键分子之一，与肿瘤发展进程密切相关。本文作者发现来自YAP1基因的4-5外显子的circRNA，circYAP（circBank ID：hsa_circYAP1_008）可以通过结合翻译起始蛋白eIF4G和PABP，抑制母基因YAP的mRNA翻译起始，调控YAP蛋白的表达量，首次发现circRNA通过调控翻译起始效率调控母基因功能（[18]）。

图17 circYAP调控YAP蛋白翻译 （[18]）

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