Molecular Cancer | circRNA调控miRNA成熟和进入外泌体增强大肠癌侵袭转移

绝大多数大肠癌（CRC）相关的死亡都是由癌细胞转移所致，然而关于原发性CRC中转移起始细胞的具体特征和潜在机制仍知之甚少，环状RNA是否参与其中也未充分阐明。2020年3月18日，一项由中山大学肿瘤防治中心谢丹教授团队带来的研究发表在Molecular Cancer上[1]，此项研究发现circLONP2通过调节miR-17的细胞内成熟和细胞间转移，在CRC发展过程中充当关键的转移起始分子，从而传播原发部位的转移起始能力和加速其他器官的转移形成，说明circLONP2可作为CRC治疗的有效预后指标或新型抗转移治疗靶标。

与传统的miRNA Sponge模型不同，本文中发现circLONP2是通过影响miR-17成熟和进入外泌体的效率调控了miRNA在细胞间的传递，进而影响了大肠癌（CRC）的转移侵袭作用。文中对circLONP2在CRC中的生成机制，调控miR-17生成及转运的机制做了深入的探索分析，为circRNA与miRNA相互调控关系提供了新的思路和借鉴案例，本文的机制也再次验证了circRNA与蛋白相互作用的研究价值。

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CRC中转移其实亚群怎么分选和鉴定的？

研究者应用transwell筛选方法，建立了具有不同转移潜能的CRC亚群：高转移潜能细胞（HM）、低转移潜能细胞（LM）、正常亲本CRC细胞（N）。再次通过体内尾静脉注射模型验证、体外迁移侵袭验证、CCK-8增殖检测及EMT标志物的WB检测验证了各亚群的侵袭能力和其他特征，确定了在不影响EMT标志物的情况下转移潜能显著增强的原发性CRC转移起始亚群。

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circLONP2在CRC转移起始亚群中高表达

随后研究者通过高通量测序和RT-qPCR检测筛选出在CRC各亚群中差异表达、且同时在CRC的转移起始亚群和已确定转移的病变组织中上调的hsa_circ_0008558（circLONP2）。

研究者通过反向剪切序列的Sanger测序、RNase R和放线菌素D处理耐受性验证、oligo dT引物检测没有poly-A，鉴定了circLONP2；并通过FISH实验发现circLONP2主要定位于细胞核。同时，研究者也探讨了circLONP2的翻译潜能，通过构建eGFP融合的circLONP2过表达质粒，发现质粒转染后不能翻译出GFP蛋白。

图1 circLONP2在CRC转移起始亚群中上调. [1]

图2通过Transwell分析法筛选具有不同转移能力的CRC亚群. [1]

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高表达circLONP2的CRC患者的癌转移及预后更差

研究者通过对97个原发性CRC组织的circLONP2表达水平检测，同时根据circLONP2表达水平对128例CRC患者进行生存分析，发现circLONP2在晚期CRC组织中的表达显著增加，circLONP2的高表达与患者不良预后相关。随后通过组织FISH检测发现circLONP2在CRC转移部位的侵袭边缘明显过表达，且circLONP2在转移性肝癌组织中的表达明显高于相对的原发性CRC组织。

图3 circLONP2与CRC患者的癌转移及不良预后相关. [1]

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FUS调控circLONP2的生成

研究者通过预测分析比对到与circLONP2侧翼内含子高度匹配的反向互补序列I7RCM和I11RCM， RT-qPCR和Northern Blot结果显示具有完整的I7RCM、I11RCM及circLONP2线性全长序列质粒可以在细胞中显著过表达circLONP2。

进一步探讨circLONP2生成的潜在机制，研究者预测到FUS可能与circLONP2的侧翼区域结合从而调控circLONP2的表达。为了验证该猜想，研究者先在两种CRC细胞（DLD-1、HCT116）中敲低FUS基因，发现circLONP2表达下调；且通过anti-FUS RIP检测到I7RCM和I11RCM显著富集。随后分析发现原发性CRC组织中circLONP2的表达与FUS的mRNA水平呈显著正相关，FUS的mRNA表达也与临床病理特征及患者的不良预后显著相关。

图4 FUS调控circLONP2的生物发生1. [1]

图5 FUS调控circLONP2的生物发生2. [1]

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circLONP2是CRC转移的重要因素

研究者在两种CRC细胞（DLD-1、HCT116）中过表达和敲低circLONP2，transwell迁移侵袭实验结果表明体外过表达circLONP2能够增强CRC细胞的迁移侵袭能力，体外敲低circLONP2则结果相反。同时尾静脉注射模型也验证了体内过表达circLONP2能够增强CRC细胞转移至肺的潜能，体内敲低circLONP2则结果相反。

图6 circLONP2是CRC转移重要因素. [1]

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circLONP2通过与DDX1直接结合来增强CRC的侵袭能力

研究者通过pulldown蛋白银染差异条带的质谱分析以及KEGG分析，找到了可能与circLONP2相互作用、且与RNA加工和修饰相关的蛋白DDX1、DDX5和DDX17，并通过pulldown蛋白产物的WB检测验证了DDX1、DDX5和DDX17与circLONP2的相互作用。

研究者为了进一步研究DDX1直接与circLONP2相互作用的确切区域，构建了带FLAG标签的DDX1的野生型质粒及截短突变型质粒，通过anti-FLAG RIP实验证明了SPRY结构域对于DDX1和circLONP2的相互作用最重要。

随后研究者通过rescue实验证明了DDX1对于circLONP2增强CRC细胞的迁移能力至关重要。

图7 circLONP2与DDX1直接结合. [1]

图8 筛选与circLONP2相互作用的潜在蛋白质. [1]

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circLONP2和DDX1协同调控pri-miR-17的加工

由于circLONP2与DDX1能够协同促进CRC迁移，而DDX1可以调节特定miRNA亚型的成熟，因此研究者推测circLONP2可能参与了miRNA的加工。为了验证该猜想，研究者筛选出circLONP2和DDX1的潜在共同靶点miR-17。随后在CRC细胞中分别敲低circLONP2和DDX1，发现circLONP2和DDX1通过调节pri-miRNA的加工来介导成熟miRNA的下调。

为了进一步探讨circLONP2和DDX1调节pri-miR-17加工的潜在机制，研究者通过突变circLONP2和pri-miR-17结合位点，验证了circLONP2可以促进pri-miR-17的加工。随后通过circRIP实验（circLONP2特异性探针调取）、pri-miR-17探针进行pulldown实验，验证了circLONP2和pri-miR-17的相互作用。

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circLONP2以DDX1依赖性方式将DGCR8募集到pri-miR-17

研究者通过IP实验证明了DDX1和DGCR8以不依赖RNA的方式相互作用，RNA pulldown结果表明DDX1介导circLONP2和DGCR8之间的相互作用，RIP结果表明circLONP2介导pri-miR-17与DDX1或DGCR8之间的相互作用。结合上文已验证结果，说明circLONP2可以直接与pir-miR-17结合，并通过DDX1间接募集DGCR8/Drosha微处理器，从而促进pri-miR-17的成熟。

研究者通过rescue实验验证了miR-17能够增强CRC细胞迁移和侵袭能力，同时发现miR-17-5p在晚期CRC组织中表达显著增加，且与circLONP2的表达及不良预后相关，在转移性肝癌组织中表达也高于原发性CRC组织，说明miR-17-5p在circLONP2驱动的CRC转移中的有致癌作用。

图9 circLONP2和DDX1协同调控pri-miR-17的加工1. [1]

图10 circLONP2和DDX1协同调控pri-miR-17的加工2. [1]

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circLONP2通过外泌体的高转移潜能驱动的miR-17-5p细胞间转移

研究者发现高转移潜能细胞（HM）及circLONP2过表达的CRC细胞均有显著增强的迁移和侵袭能力，而使用GW4869抑制外泌体分泌则大大扭转了这种影响。随后鉴定了CRC细胞中提取的外泌体，检测到外泌体中miR-17-5p的显著富集。进一步验证了miR-17-5p可以通过外泌体转移到受体细胞，并且发现miR-17-5p外泌体可以影响受体细胞中miR-17-5p靶标基因PTEN的表达。

研究者发现circLONP2过表达增加了外泌体的数量和miR-17-5p的水平，circLONP2敲低则相反；而circLONP2过表达和敲除均不影响外泌体分泌相关蛋白RAB27A和RAB27B的表达。说明circLONP2控制的外泌体分泌过程有着复杂调控网络。

研究者还发现miR17-5p外泌体增强了CRC细胞迁移和侵袭能力，且去除从circLONP2过表达的细胞中提取的外泌体后，受体细胞的高转移潜能可以维持至少5天。说明circLONP2驱动的外泌体包装和miR-17-5p的转移在受体细胞中诱导了可持续的高转移潜能。

图11 circLONP2通过外泌体的高转移潜能驱动的miR-17-5p细胞间转移. [1]

图12 外泌体miR-17-5p传播高转移潜能. [1]

参考文献

1. Han K., et al., circLONP2 enhances colorectal carcinoma invasion and metastasis through modulating the maturation and exosomal dissemination of microRNA-17. Mol Cancer. 2020 Mar 18; 19(1): 60.

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