关于RIP的那些事儿

近段时间，老王在研究RNA与蛋白相互作用的过程中，发现了一个近两年来颇受关注的实验技术-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RNA结合蛋白免疫沉淀)，顾名思义就是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。

RIP实验的目的是分析与目的蛋白结合的RNA，原理则是运用针对目的蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或PCR分析。

2016年9月23日，意大利Maria R. Matarazzo教授在Methods in Molecular Biology杂志介绍了RIP实验的经典操作方法[1]（推荐阅读：RIP实验方法）。文中介绍的RIP实验操作流程如下图所示：

图1 经典RIP实验操作流程（来自[1]）

对于完整的RIP实验流程，老王也画了个中文版简图可以帮助大家更好的理解RIP实验操作。

图2  RIP原理流程图

而RIP实验有哪些应用呢？大家都知道RNA是一种不稳定的生物大分子，绝大多数RNA都需要与特定的RNA结合蛋白形成RNA-蛋白复合物才能稳定存在于细胞中。RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控，包括剪接（splicing）、出核转运（nuclear export）、mRNA稳定性以及蛋白转译过程。因此，对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化，RIP技术应运而生，可应用于研究miRNA调节靶点、RNA与RNP（RNA结合蛋白）的互作关系等。

案例

1

RIP用于研究circRNA与蛋白互作

图3 circ-Foxo3在细胞周期进程中的作用（来自[2]）

图4 RIP和qPCR检测，揭示了circ-Foxo3与蛋白p21和CDK2的关系（来自[2]）

在本研究中，通过p21和CDK2等多种蛋白抗体的RIP实验验证了circ-Foxo3通过与蛋白p21和CDK2的结合[2]。

案例

2

RIP用于研究lncRNA与蛋白互作

图5 lncRNA和编码RNA与EZH2结合能力的比较（来自[3]）

在本研究中，使用EZH2特异性抗体对人胃癌细胞系MKN45和AGS，以及对照细胞系GES-1进行RIP-seq，分析了8256个与EZH2相关的RNAs，包括编码和非编码RNAs，其中MALAT1在MKN45细胞系中高表达。并且发现MALAT1通过和EZH2相互作用，抑制原钙黏蛋白因子10（PCDH10）的表达，从而促进胃癌细胞的侵袭和转移[3]。

案例

3

RIP用于研究miRNA与蛋白互作

图6 缺铁性和非缺血性NPCs中isomiRs分析（来自[4]）

在本研究中，利用Ago2 RIP-seq，分析非缺血性和缺血性成年大鼠侧脑室下区（SVZ）的神经祖细胞（NPCs）miRNAs的表达情况[4]。

结果显示，相较于非缺血性NPCs，中风改变了NPCs中Ago2相关的miRNAs表达，缺血性NPCs中的isomiRsreads数增加，其中5'末端添加核苷酸的isomiR-142-5p_L+2R-1显著上调，5'末端缺失核苷酸的isomiR-187-5p_L-2R+3显著下调[4]。

说到RIP，就不得不提一下它的搭档RNA pull-down技术。我们知道，RIP是从蛋白出发研究蛋白RNA相互作用的技术，通过已知蛋白去验证可能有相互作用RNA分子；而RNA pull-down则是从RNA出发研究蛋白与RNA相互作用的技术，通过已知RNA去拉蛋白，推测可能与已知RNA结合的蛋白分子，后续可通过WB验证相互作用。所以RIP和RNA pull-down两种技术可以从正反双向进行验证，能更准确的反映RNA与蛋白的相互作用。

案例

4

综合利用RNA pull-down和RIP用于研究lncRNA与蛋白相互作用

本研究首先通过RNA Pulldown和后续质谱实验找到了与lncRNA MEG3结合的蛋白PTBP1，然后再通过PTBP1的抗体的RIP实验反向验证了lncRNA MEG3与PTBP1蛋白的结合[5]。

图7 RIP揭示HEK293T细胞中PTBP1蛋白与MEG3 RNA的相互作用（来自[5]）

上图中MEG3和PTBP1是要研究的分子，Hprt1是阴性对照。Input是未经IP的对照，IgG是用来判断非特异性扩增的对照，PART1是阳性对照（已知与MEG3结合的蛋白）[5]。

脑洞

有意思的是，我们在研究中发现，同一个RNA，无论是microRNA还是lncRNA或者circRNA，他们的靶蛋白很可能不仅仅只有一个，运用RIP实验技术，得到RNA-蛋白复合物，分离复合物中的RNA，经过逆转录或构建cDNA 文库，最后利用基因特异性分析技术（PCR、qRT-PCR）或高通量分析技术（高通量测序、基因芯片），分析复合物中RNA的类型及多少；而分离RNA-蛋白复合物中的蛋白，通过质谱或蛋白组测序等方法，还可以用来研究与目标蛋白结合的RNA的其他互作蛋白，蛋白研究非RIP的初始目的，感兴趣的可以充分发挥想象力，惊和喜随时在等你！

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参考文献

1. RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods Mol Biol, 2016. 1480: p. 73-86.

2. Foxo3 circular RNA retards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2.Nucleic Acids Res. 2016 Apr 07;44(6)

3. MALAT1 long ncRNA promotes gastric cancer metastasis by suppressing PCDH10.Oncotarget. 2016 Mar 15; 7(11): 12693–12703.

4. Identification of miRNomes associated with adult neurogenesis after stroke using Argonaute 2-based RNA sequencing.RNA Biol. 2017; 14(5): 488–499.

5. Long noncoding RNA MEG3 induces cholestatic liver injury by interaction withPTBP1 to facilitate shp mRNA decay.Hepatology 2017 02;65(2)

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