除了miRNA Sponge，这篇Molecular Cancer文章还做了circRNA的生成机制

circRNA研究已经经历了多年的飞速发展，circRNA作为miRNA Sponge的功能模型报道也越来越多，如何在这个模型研究的基础上更深入的探索circRNA的机制的问题越来越受到重视。最近发表在Molecular Cancer杂志的一篇文章除了报道miRNA Sponge功能，还对所研究的circRNA的来源机制进行了分析。文章的通讯作者是重庆医科大学的陈俊霞教授。该文章报道发现三阴性乳腺癌中circSEPT9高表达，且与不良预后有关。机制方面，circSEPT9通过竞争性结合miR-637，激活LIF/STAT3通路，作者还发现E2F1和EIF4A3分别结合了SEPT9基因的启动子和转录前体RNA，对circSEPT9的生成有调控作用（[1]）。

三阴性乳腺癌中circSEPT9表达鉴定

作者通过4对三阴性乳腺标本的癌和癌旁组织的测序分析，发现了一些癌组织特异性高表达的circRNA分子，其中包括circSEPT9。circSEPT9由SEPT9基因的第二外显子环化形成，主要定位于胞质。

图1 三阴性乳腺癌中circSEPT9表达鉴定（[1]）

E2F1与EIF4A3参与调控circSEPT9的生成

circRNA具有组织和疾病特异性的表达特征，本文的工作中发现了circSEPT9在三阴性乳腺癌中特异性高表达，那么是什么机制介道了这一特异性变化呢？探索circSEPT9的生成机制可以回答这个问题。作者发现在MDA-MB-231和BT-549细胞中过表达和敲降E2F1可以影响SEPT9的表达，表明E2F1参与了SEPT9的转录。荧光素酶报告基因也证明了这一点，将SEPT9启动子区做成荧光素酶报告基因，如果将其中的E2F1结合位点突变，可显著影响下游基因的转录。ChIP实验也验证了E2F1结合在SEPT9启动子区。

circInteractome数据库预测了circSEPT9侧翼内含子的RBP结合位点，发现在两次存在EIF4A3的结合位点。RIP实验证明了EIF4A3结合SEPT9前体RNA。过表达EIF4A3可显著增加circSEPT9的表达，而干扰EIF4A3则显著抑制circSEPT9的表达。

图2 E2F1与EIF4A3参与调控circSEPT9的生成（[1]）

三阴性乳腺癌中circSEPT9显著高表达，且与不良预后有关

作者分析了circSEPT9在三阴性乳腺癌细胞系和临床标本中的表达水平，发现circSEPT9的高表达与三阴性乳腺癌的不良预后有关。

图3 三阴性乳腺癌中circSEPT9高表达，与不良预后有关（[1]）

circSEPT9与迁移侵袭的关系

MDA-MB-231和BT-549细胞中干扰circSEPT9可抑制细胞的增殖，迁移和侵袭。

图4 circSEPT9与迁移侵袭有关（[1]）

干扰circSEPT9可诱导细胞周期G0/G1期阻滞，诱导细胞凋亡

为探索circSEPT9在三阴性乳腺癌中的功能机制，作者分析了干扰circSEPT9后细胞周期的变化情况。结果发现干扰circSEPT9后可诱导细胞周期的G0/G1期阻滞，导致CCND1，CCNE1，CDK4等周期蛋白的表达下降。细胞凋亡检测结果表明干扰circSEPT9后可增加凋亡细胞的比例。

图5 干扰circSEPT9诱导细胞周期阻滞和凋亡（[1]）

circSEPT9竞争性结合miR-637

预测结果表明circSEPT9带有两个miR-637的结合位点，QPCR分析表明过表达circSEPT9能降低miR-637的表达水平而干扰circSEPT9后miR-637表达增高，两者表达水平具有相反的变化趋势，临床标本的检测结果也印证了这一关系。荧光素酶报告基因实验，FISH共定位分析，RNA Pull-down实验验证了circSEPT9与miR-637的相互作用。证明了circSEPT9可以竞争性结合miR-637。

图6 circSEPT9竞争性结合miR-637（[1]）

进一步，作者还分析了干扰或过表达circSEPT9后过表达miR-637的效应，结果显示，miR-637过表达能抑制circSEPT9的作用。

图7 circSEPT9竞争性结合miR-637（[1]）

circSEPT9抑制miR-637，调控LIF/STAT3通路

预测分析表明LIF是miR-637的下游靶基因，过表达miR-637后LIF表达显著下降。荧光素酶报告基因，临床标本表达相关性分析实验均验证了三阴性乳腺癌中miR-637与LIF的相反变化关系和调控作用。干扰或过表达circSEPT9能抑制miR-637的作用。

图8 circSEPT9竞争性结合miR-637，调控LIF/STAT3通路（[1]）

体内成瘤分析表明circSEPT9具有促癌作用，与肝转移有关

最后，作者通过裸鼠实验分析了circSEPT9对成瘤能力和转移的影响。结果表明干扰circSEPT9可降低成瘤速度，降低肝转移效率。过表达circSEPT9促进肿瘤生长，也促进肝转移。表明circSEPT9具有促进肿瘤生长和转移的作用。

图9 体内circSEPT9促进肿瘤（[1]）

参考文献

1. Xiaying Zheng, M.H., Lei Xing, Rui Yang, Xiaosong Wang, Rong Jiang, Luyu Zhang, Junxia Chen, The circRNA circSEPT9 mediated by E2F1 and EIF4A3 facilitates the carcinogenesis and development of triple-negative breast cancer. Molecular Cancer, 2020.

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