Molecular Cancer | circFNDC3B编码蛋白可抑制结肠癌

circRNA翻译是非常受关注的研究思路，近几年已经有十余篇研究报道。4月2日，Molecular Cancer杂志发表了一项circRNA翻译蛋白的研究工作，报道结肠癌中circFNDC3B编码蛋白可以抑制Snai1表达并抑制EMT和肿瘤进展。中山大学附属第三医院郑俊和张磊，悉尼大学Storr肝病研究中心乔梁教授为本文的共同通讯作者（[1]）。

结肠癌中circFNDC3B的发现和鉴定

circFNDC3B由FNDC3B基因的5和6外显子形成，作者设计反向引物验证了结肠癌中circFNDC3B的存在，Sanger测序验证了接口位置的序列。RNase R实验，放线菌素D实验，FISH实验分析了circFNDC3B分子的基本情况，结果显示circFNDC3B主要定位在细胞质中。临床标本检测结果表明circFNDC3B在结肠癌中显著低表达，临床标本中，circFNDC3B表达低的患者预后更差。

图1 结肠癌中circFNDC3B的发现和鉴定 （[1]）

circFNDC3B抑制细胞增殖和迁移侵袭

功能实验表明过表达circFNDC3B抑制细胞增殖和迁移侵袭，干扰circFNDC3B则促进细胞增殖和迁移侵袭。

图2 circFNDC3B抑制细胞增殖和迁移侵袭 （[1]）

circFNDC3B编码蛋白鉴定

序列分析表明circFNDC3B存在一个大于一圈的ORF。circFNDC3B长度526nt，这个一圈多的ORF总长度657nt，预测的蛋白序列有218aa。序列比对的结果显示这个218aa的序列的N端有一段不同于FNDC3B母基因蛋白的独有序列。ORF的上游有一段序列可能有IRES的功能，荧光素酶报告基因的验证证明了这一段的确具有IRES功能。为验证circFNDC3B的翻译产物，作者构建了四个载体进行验证分析：

（1）Lv-vector：慢病毒空载体。

（2）Lv-circFNDC3B-flag：将Flag序列融合至预测ORF中。融合位置为ORF的中间，避免了这种ORF占了一圈多的情况下在N端或C端融合导致的插入Flag序列对ORF的改变过大的问题。本文的Flag融合位置设计在93位氨基酸后面，该位置避开了ORF终止密码子的位置（circFNDC3B-218aa的终止密码子与91和92位的氨基酸有序列交叠）。

（3）Lv-circFNDC3B-flag-mut：Flag序列融合至ORF中，但其实密码子突变为ACG。

（4）Lv-circFNDC3B-218aa：直接表达线性的circFNDC3B-218aa ORF，C端融合Flag序列。

四种病毒载体感染细胞后，有circFNDC3B的载体显著增加了circRNA的表达水平，但所有的载体对FNDC3B母基因的影响都非常低。WB实验验证了circFNDC3B-218aa的翻译产物，用了两种抗体检测：一个是anti-Flag的抗体，验证了融合Flag后的circFNDC3B-218aa表达，起始密码子突变后这个条带消失。另一个是anti-FNDC3B的一种商业化抗体，也可以识别circFNDC3B-218aa，这种商业化抗体也检测到了Flag融合后的蛋白条带，同时在病毒载体表达产物不能准确翻译circFNDC3B-218aa的两组中也有很弱的条带出现，可能是细胞内源circFNDC3B-218aa产物的条带。最后，作者从IP产物的蛋白质谱中找到了具有circFNDC3B-218aa特有氨基酸序列的蛋白质谱峰。

图3 circFNDC3B编码蛋白鉴定 （[1]）

circFNDC3B-218aa是circFNDC3B发挥功能的关键

前面的结果中circFNDC3B具有抑制细胞增殖和迁移侵袭的作用，那么是circFNDC3B作为非编码RNA的属性起的作用，还是其编码的蛋白起的作用呢？基于上述设计的突变载体，作者分析了四种载体的功能情况，结果表明circFNDC3B-218aa是发挥功能的关键。

图4 circFNDC3B编码蛋白而非RNA发挥功能 （[1]）

circFNDC3B-218aa体内抑制肿瘤生长

体内实验也证明circFNDC3B-218aa可显著抑制肿瘤生长速度。起始密码子突变后的circFNDC3B影响不明显。

图5 circFNDC3B-218aa体内抑制肿瘤生长 （[1]）

circFNDC3B-218aa调控Snai1和FBP1表达

为分析circFNDC3B-218aa的功能机制，作者通过RNA-seq分析了过表达circFNDC3B-218aa前后基因表达差异情况。发现circFNDC3B-218aa可以促进FBP1的表达而抑制Snai1的表达。细胞和动物实验的标本也验证了这些现象。

图6 circFNDC3B-218aa调控Snail和FBP1表达 （[1]）

circFNDC3B-218aa通过Snai1调控FBP1，抑制EMT

已知Snai1可以负调控FBP1的表达，那么circFNDC3B-218aa是不是通过Snai1调控了FBP1的表达呢？作者通过过表达circFNDC3B-218aa后过表达Snail的实验验证了这个假设。单独过表达circFNDC3B-218aa能抑制肿瘤迁移侵袭，但同时过表达Snail能抵消单独过表达circFNDC3B-218aa的效应。

图7  circFNDC3B-218aa通过Snai1调控FBP1 （[1]）

circFNDC3B-218aa功能机制模型

circFNDC3B在结肠癌中通过翻译一个218aa的蛋白，负调控Snai1的表达，进而释放了Snai1对FBP1的抑制效应，FBP1进而抑制EMT，抑制肿瘤进展。

图8 circFNDC3B-218aa功能机制模型 （[1]）

本文关于circRNA翻译蛋白的研究相对比较全面，对于circRNA翻译产物的验证和鉴定有较高的参考价值。美中不足的是对天然表达的circFNDC3B-218aa蛋白的WB验证实验证据偏少，只有在商业化抗体验证的实验中有两个对照组的条带结果，如果能在细胞系（如NCM460细胞等非肿瘤细胞系）或病人标本组织（癌旁组织，非肿瘤的结肠组织等等）中验证一下天然的circFNDC3B-218aa分子就更全面了。

参考文献

1. Pan, Z., et al., A novel protein encoded by circFNDC3B inhibits tumor progression and EMT through regulating Snail in colon cancer. Mol Cancer, 2020. 19(1): p. 71.

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