前沿|RNA干扰技术——沉默疾病的钥匙？

一. RNA干扰定义

RNAi （RNA interference），是一种由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的，对其同源的mRNA进行高效、特异性降解的现象，属于PTGS（Post-transcriptional Gene Silencing，转录后基因沉默）。

实际上，RNAi的本质是一种由miRNA介导的序列特异性的获得性免疫反应，是一种原始的基因组对抗外来基因表达的保护机制，是生物体在基因组水平上的免疫系统——抵抗病毒入侵，抑制转座子的活动，并对自身基因的表达进行监控等。

二.RNA干扰特点

事实上，RNA干扰广泛存在于真核生物（如，烟草、线虫、果蝇、小鼠、人等）中的序列特异性转录后基因沉默过程，是生物体在进化过程中,抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起基因组不稳定性的保护机制。dsRNA只会特异性的诱导与其同源的mRNA降解（siRNA对碱基错配的容忍度非常低，即使只是一个碱基错误都会极大地降低沉默效率和效果），对于其他的无关基因的正常表达不会有影响。而且RNAi的触发具有“扩增”的机制，所以相对极其少量（远远小于同源的mRNA数量）的dsRNA就可触发强烈的“干扰”效应，致使大量的靶基因沉默。

三.RNA干扰研究历程

1990年在对矮牵牛进行的研究的时候发现：将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮脚牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待中的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。后将这种现象命名为协同抑制，因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。刚开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象，后来发现在其他许多植物中，甚至在真菌中也有类似的现象。

1995年康乃尔大学的研究人员尝试用反义RNA去阻断par1基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNA的确能够阻断par1基因的表达，注入作为对照的正义链RNA，也同样阻断了基因的表达。1998年，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello将双链dsRNA注入线虫，结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。这种现象后来被称为RNA干扰。在随后的短短一年中，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组学研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。

2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学Andrew Fire和Craig Mello，表彰他们发现了RNA干扰现象。

四.RNA干扰应用场景

由于RNA干扰技术沉默目的基因的前景很吸引人，因此有大量研究希望使用这一手段进行生物学研究或治疗人类疾病，主要有以下应用：

1.功能基因组的研究

在过去几年中，RNAi已被成功地应用于植物、线虫、真菌、昆虫等研究中。果蝇是一种广泛应用的模式生物，利用RNAi技术分别tinman和wingless的dsRNA注入果蝇早期胚胎，得到这两个基因的干扰表型，与这两个基因的突变体表型非常相似，都表现为果蝇心脏前体细胞不能形成或心脏管缺失。通过此例子表明，在功能基因组研究中RNAi干扰技术已经成为一种快捷、简便的工具。

2.研究信号传导通路

联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系，由于RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点，因此认为RNAi技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。

3.临床应用

RNAi可能用于肿瘤治疗。肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以敲低多个基因，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时抑制。

RNAi也可能在遗传病和疼痛的治疗中也有应用。将化学合成的siRNA通过阳离子脂类转染试剂导入原代培养的大鼠神经元，显著抑制内源靶基因和转染基因的表达，抑制神经元NO合成酶表达能有效降低疼痛。

五.RNA干扰临床最新进展

2017年12月18日，赛诺菲与美国RNAi药物领先开发商Alnylam Pharmaceuticals表示，双方已经向欧盟EMA提交了patisiran的上市许可申请。patisiran是一款靶向运甲状腺素蛋白（TTR）的用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性成人患者的RNAi疗法，这是第一个申请上市的RNAi药物。

2018年，Alnylam Pharmaceuticals公布了Givosiran的1期和2期研究的最新结果。Givosiran是一种靶向氨基乙酰丙酸合成酶1的RNAi治疗方法，用于治疗急性肝卟啉症。结果表明，每月接受Givosiran治疗的患者尿亚氨基乙酰丙酸（ALA）降低80％以上，疾病生物标志物和平均年化卟啉症发作率降低75％以上。越来越多的RNA干扰疗法将从研究走向临床。

六.RNAi的发展趋势

尽管RNAi的分子机制了解的已经比较清楚，而且在疾病治疗、基因组分析中也有了一定的应用，但是RNAi仍然有一些缺陷需要解决。例如应用的广泛性，siRNA并不能作用于所有目标RNA序列，某些序列可能位于折叠部位，难以结合。特别是在临床应用时，仍然有很多不成熟的地方。比如不同种mRNA的交叉造成的复杂性，使siRNA的结合准确性下降。还有就是在作为药物时，给药方式的选择，如何做到RNA序列的有效递送，在全身的分布对药物有效性的影响等，因此RNAi作为一个富有希望的治疗手段还有很长的路要走。

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