日本科学家阐明：绝大多数抗癌药物为何药效低副作用大？
►日本熊本大学医学院名誉教授、日本崇城大学教授前田浩
编者按：
2016年诺贝尔化学奖已尘埃落定，三位从事分子机器研究的科学家获此项殊荣。不可忽视的是，除这三位之外，还有很多科学家也做出了卓越成就，其中有些人更被汤森路透预测为今年诺贝尔化学奖获得者。日本熊本大学医学院名誉教授、日本崇城大学教授前田浩（Hiroshi Maeda）便是其中一位。
撰文 | 吴军（美国希望之城医学中心）
责编 | 程莉
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2016年的诺贝尔化学奖已经尘埃落地，三位从事纳米机器设计的科学家获得了此项殊荣。
在揭晓前几天，朋友通过微信告诉我说，我的博士导师、日本熊本大学医学院名誉教授前田浩（Hiroshi Maeda）博士（现任日本崇城大学教授）被汤森路透（Thomson Reuters）预测为2016年诺贝尔化学奖获得者之一。汤森路透是一家国际专业数据分析公司，他们根据学术论文的引用数量等进行预测，自2002年至2015年共预测了256名诺贝尔奖得主候选人，其中39人已经获奖。前田教授与松村博士是被预测获得2016年化学奖的三组科学家之一。
虽然前田教授又一次与诺贝尔奖擦肩而过，但因为汤森路透的预测，前田教授的名字和他的理论通过全球媒体的报道而进入公众视野。鉴于绝大多数华人读者不知道前田教授及其科学研究的成就，我感到有责任来介绍一下前田浩教授及其科学贡献。
我是1994年通过获得日本政府文部省外国留学生奖学金进入到前田浩教授实验室读博士的。之所以要到前田浩教授那里求学，是因为我在1992年读了上海医科大学汤钊猷教授编著的一本关于肝癌治疗的书，里面有一章是前田浩教授写的关于一种叫SMANCS的药物，与碘油Lipiodol混合后通过肝动脉注射，这个药在肝癌组织里能够选择性地潴留，而且长达数月，从而达到高效的抗癌效果，同时副作用极小，患者两天后即可出院，过正常的生活。我当时认识到，这就是最理想的癌症治疗方法了：疗效高、副作用小、伤害小，不影响正常生活质量。我因此写信给前田浩教授，希望到他的实验室读书。幸运的是，我成为他的三个中国留学生之一。
早期研究
前田教授1962年本科毕业于日本的东北大学。这所大学位于日本仙台市，是日本的7所旧帝国大学之一。大学毕业后，前田获得美国的Fulbright研究生奖学金，到美国加州大学戴维斯分校，师从Robert E. Feeney学习蛋白质化学及蛋白酶抑制物。那是蛋白质化学和生物化学最激动人心的大发展时期。在获得硕士学位后，前田回到仙台的东北大学，师从石田名香雄教授，进行抗生素的研究。石田名香雄是世界知名的微生物学家，曾经发现了著名的仙台病毒，是日本抗生素研究的领导者，曾任东北大学校长，门下学生多成为日本各大学的知名教授。前田的课题是一种新发现的抗生素-新制癌菌素Neocarzinostatin （NCS）。NCS具有高度敏感的抗细菌和肿瘤的活性，它的结构非常特殊，由113个氨基酸的蛋白链和切断DNA的色素团Chromophore组成。前田负责确认这个新抗生素的蛋白质序列。
1968年5月，前田在获得博士学位后，应哈佛大学医学院教授Sidney Farber的邀请，来到美国波士顿的儿童癌症研究基金会（CCRF）工作，目的是确认NCS的结构。CCRF后来成为目前世界著名的Dana-Farber Cancer Institute。Farber教授是世界癌症化疗的先驱者之一，曾经担任美国抗癌协会主席。前田在这段时间，还到了加州大学旧金山分校（UCSF）的荷尔蒙研究室的Choh Hao Li（李卓皓）教授的实验室工作，李卓皓教授是当时世界最著名实验内分泌科学家之一，发现和纯化了多种激素，曾经有300多位来自世界各地的科学家在他的实验室工作。据前田跟我说，在李卓皓实验室短短两个星期，他受益良多。
在完成了NCS结构分析工作之后，1971年前田博士接受来自日本熊本大学医学院日沼頼夫（Yorio Hinuma）教授的邀请，来到熊本大学医学部微生物学研究室担任副教授。熊本大学医学部是一所老牌的医学院，历史可以追溯到18世纪，是日本在7所帝国大学医学院之后最著名的医学院之一，具有优良的研究传统。日沼頼夫教授也是世界著名的微生物学家，以发现成人T细胞白血病病毒而著名，于2009年获得日本文化勋章。日沼頼夫教授后来去京都大学病毒研究所担任教授，前田博士随后成为熊本大学医学部微生物学教授。
神奇的SMANCS
在熊本期间，前田教授继续研究NCS。NCS虽然有高效的抗癌活性，但是很容易在体内被蛋白酶降解而失活，在血液中半衰期极短。前田一直想办法改善NCS的药物动力学特性。有一次，他读到美国化学协会主办的《化学与工程新闻》周刊，其中报道说SMA（styrene-co-maleic anhydride）这种兼有水溶/疏水性质的多聚物可以用来做汽车打蜡和地板打蜡用。于是，前田想到用这个多聚物来修饰他的NCS。很快，他从美国ARCO公司获得SMA赠品用来修饰NCS，得到了合成产物。他把这个产物命名为SMANCS。后来他又用n-butyl half-ester的SMA来完善SMANCS。SMANCS的药物动力学性质比NCS获得了极大的改善：抗癌活性保持不变，血液中的半衰期大大延长，抗蛋白酶降解的稳定性大大提高，也几乎不引起免疫原反应（身体产生抗NCS抗体）。因为有了SMA的修饰，SMANCS可以增加其疏水性性质，同时又能够与血液中的白蛋白Albumin结合，成为9万道尔顿的大分子。
当时在熊本大学医学院第一外科工作的外科医生今野俊光（Toshimitsu Konno）博士建议把SMANCS与血管造影剂Lipiodol溶在一起，看看能否帮助治疗癌症。他们首先在携带VX-2肿瘤的兔子身上做实验，证明SMANCS可以溶解在Lipiodol当中并聚集在VX-2肿瘤组织里。因SMANCS在动物身上获得成功，第一外科教授横山育三（Ikuzo Yokoyama）问前田教授能否用SMANCS来治疗一位56岁的肝癌病人。这位患者的肝癌直径有13厘米之大，预料最多只能存活4～5个月。
治疗由今野博士实施，通过肝动脉插管给药。当患者在3个月后复查时，今野医生吃惊地发现，患者活得好好的，肿瘤大大缩小了。这是前所未有的事情。
今野医生兴奋地拿着患者的CT片冲进前田教授的办公室，告诉他这个令人振奋的结果。横山教授、今野博士、前田教授意识到SMANCS具有奇迹般的能量，他们决定让更多的患者接受这个SMANCS的治疗。1982年，他们的临床治疗结果发表在日文的《癌症与化疗》期刊上，1983年发表在欧洲癌症临床肿瘤学杂志（Eur. J., Cancer Clin. Oncol., 19:1053-1065）上。
随着SMANCS治疗肝癌的成绩的陆续发表，1993年日本政府批准SMANCS全面进入临床治疗应用。日本各地乃至来自美国的患者都争相到熊本接受SMANCS治疗，前田博士因此还收到美国奥斯丁市颁发的荣誉市民和美国奥克拉玛州颁发的荣誉居民称号。大约1999年，我跟今野博士到临床观摩SMANCS治疗的期间，今野博士告诉我说，他认为肝癌如果不是特别的晚期，比如出现全身转移黄疸腹水等症状，在他看来，肝癌已经是可治愈的疾病。
发现大分子物质在肿瘤血管高渗透及潴留的EPR效应
►伊文斯蓝在肿瘤组织的 EPR 效应及 SMANCS 利用 EPR 效应在肝癌组织中的靶向治疗效果
在研发SMANCS的同时，前田注意到NCS及SMANCS的淋巴系统趋向性。肿瘤也是通过淋巴系统进行扩散的。大分子物质、脂质体也是通过淋巴系统回流到血液。伊文斯蓝Evans Blue是一种蓝色的染料，用来发现血管渗透性增高的现象。前田教授在研究细菌蛋白酶的病理学机制时常用这个染料。他们发现这个染料也可以让肿瘤组织出现特异性的染色现象。
1980年代末，松村保宏（Yasuhiro Matsumura）来到前田的实验室读博士。松村是一名外科医生，现任日本国立癌症中心东医院药物发展部部长。松村一开始研究癌症腹水中出现的缓激肽（Bradykinin）的现象。缓激肽是一种强烈的刺激痛觉同时刺激血管渗透性的生理因子。为了研究缓激肽在肿瘤血管渗透性方面的生理作用，他们对肿瘤组织的血管高通透性感到兴趣并开展进一步的研究。他们用铬51来标记了不同分子量的大分子：IgG（160kDa）、transferrin（90kDa）、albumin（67 kDa）、ovalbumin（47 kDa）和ovomucoid（28.8 kDa）、NCS（12 kDa），然后把这些放射物标记的蛋白注射到携带肿瘤的小鼠静脉中去。他们发现，40 kDa大小以上的大分子，随着时间的推移，在肿瘤组织里出现了潴留的现象，而在其他任何正常组织当中，这些大分子都没有出现漏出到血管外的现象。这阐明了肿瘤血管对大分子物质有独特的渗透性增加的现象（enhanced permeability）。更重要的是，这些漏出来的大分子，出现了潴留的现象（retention effect）。这个潴留现象，就是一种我们需要的药物被动性肿瘤靶向药物递呈作用。也就是说，要让抗肿瘤药物选择性地到达肿瘤组织发挥抗癌功效，抗癌药物应该在40kDa大小以上，或者能够主动与血液中的白蛋白结合，以药物-白蛋白结合体的形式在血液中运动。
►大分子化合物对肿瘤组织的高渗漏和潴留特性
这也同时阐明了绝大多数抗癌药物的药效低副作用大的原因：绝大多数抗癌药物，其分子量只有区区2kDa以下。它们在患者身体里以自由扩散原则分布到身体中的各个部分去，“自由扩散”使得在肿瘤组织中的药物浓度极低，也就意味着抗癌效果低；“到处都去”导致副作用大。1986年，前田与松村把这个现象称之为enhanced permeability and retention effect（简称EPR effect），他们将研究论文发到美国的《癌症研究》（Cancer Research）杂志后，两位论文评议员中一位评论说：这个是令人振奋的发现，马上付印！（Fantastic findings! Send to the press immediately！）。
我在前田实验室的研究课题，就是进一步阐明EPR effect的机制。我们用不同分子量大小的HPMA多聚物，再次证明了EPR effect。同时，我们也证明了除缓激肽之外，一氧化氮（nitric oxide）、前列腺素类（prostaglandins）、胶原蛋白酶／金属蛋白酶（collagenases/MMPs）都是促进/维持EPR效应的病理因子。
►分子量在4万道尔顿以上的 HPMA 多聚物才表现出 EPR 效应
EPR effect理论很快得到世界著名科学家的认同和支持，其中有英国伦敦大学的著名科学家Ruth Duncan教授、德国Mainz大学的Helmut Ringsdorf教授、美国Virginia Commonwealth 大学William Regelson教授、美国哈佛大学医学院的Juldah Folkman教授等一大批世界著名学者。
从2002年开始，关于EPR effect概念的引用率开始增加，到2006年以后出现井喷现象，全世界几乎所有用纳米材料、多聚物、抗体、脂质体等大分子作为抗癌药物研发的学者，都在引用EPR effect作为他们的设计理论基础。汤森路透这次之所以推测前田和松村获得诺贝尔化学奖，就是因为EPR effect的高引用率。汤森路透社因此授予前田教授2016年度最具影响力和论文引用奖（Thomson Reuter Award for most influential and cited paper for 2016）。
►EPR 效应的引用率令人瞩目
1997年，日本最著名的癌症学术荣誉奖——高松宫妃癌研究基金学术奖，颁发给了前田教授，以表彰他的SMANCS研发和EPR effect理论的卓越成就。2003年，美国控制释放学会（Controlled Release Society）／东京永井纪念药学基金会（Nagai Foundation）授予前田CRS Nagai Innovation Award。2007年，英国皇家药学会授予前田终身成就奖（Life Time Achievement Award）。2010年，前田获得著名的第70届西日本文化功劳奖。2011年，前田获得日本药物递呈学会最高奖－－Nagai奖，同年获得日本癌症学会的最著名的Tomizo Yoshida奖。
阐明细菌蛋白酶致病机制
前田教授是一个研究兴趣广泛的科学家，实际上他在细菌蛋白酶的病原机制研究上也有很大的建树。他和他的研究生阐明细菌的蛋白酶是引起炎症破坏的主要元凶之一，抑制细菌蛋白酶的破坏作用是治疗恶性细菌感染（例如眼角膜感染）的重要方法。细菌蛋白酶还可以促进病毒（例如流感病毒）的增殖、入侵和引发病变。细菌蛋白酶通过激活激肽（Kinin）连锁反应导致炎症和血管渗透性改变，是其中重要的病理机制之一。因对细菌蛋白酶和激肽的研究成就，他在1995年获得日本细菌学会颁发的最高奖Asakawa奖、1998年获得德国E.K. Frey-E.Werle基金会颁发的Commemorative Gold Medal Award。
阐明流感病毒感染过程中的超氧自由基病理损伤机制
在研究细菌蛋白酶的致病机制的同时，他和他的研究生赤池孝章（Takaaki Akaike，现为日本东北大学教授）一道，阐明了超氧阴离子自由基（superoxide anion radicals， ROS，O2˙ˉ）在流感病毒导致的致死性病理损伤中的重要机制。他们发现，在流感病毒感染的第4～5天，病毒数量达到顶峰。到第8天，被感染的小鼠开始死亡，这个时候，小鼠血液里已经检测不到流感病毒的存在。这个现象，是对德国细菌学家罗伯特科赫提出的“在感染部位必然找到微生物致病源的法”的极大补充。他们还发现，在被感染的小鼠肺部有大量的超氧自由基（ROS）产生，这些ROS是破坏小鼠肺功能、导致小鼠死亡的原因，因为他们使用经吡喃复聚物（pyran copolymer）修饰的超氧化物歧化酶SOD，可以让98%的被感染的小鼠免于死亡。
这个发现其实揭示一个重大的医学原则，即很多病毒性的疾病，比如SARS病毒和流感病毒，其治疗的关键点在于抑制过量自由基的产生导致的呼吸系统损伤，而不是用滥用大量激素。
他们还发现一氧化氮（nitric oxide）也随ROS的发生而同步产生，恶化病理损伤。他们因此对nitric oxide、peroxynitride等一系列自由基离子进行了系列研究，获得诸多研究成果。前田与赤池因此成为日本一氧化氮研究领域的领导者，先后担任日本一氧化氮学会主席和国际一氧化氮学会的主席。
诺贝尔奖实在是可遇而不可求。前田教授虽然没有获得2016年诺贝尔奖，但他的科学成就深受国际学术界同行尊敬。
我去年7月专程去探望前田教授时，年近80岁的前田教授，依然精神矍铄，拿出他最新的研究开发的高分子抗癌药物，希望我能够帮他在国际上找到合作伙伴，共同进行临床试验。他对研究的充满活力的热情、渊博的知识、对学术关键点的敏感，对创新的激情和励行，一直都在鼓励我从事科学研究。
参考文献：
1. Maeda H. The link between infection and cancer: tumor vasculature, free radicals, and drug delivery to tumors via the EPR effect. Cancer Sci. 2013 Jul;104(7):779-89.
2. Fang J, Nakamura H, Maeda H. The EPR effect: Unique features of tumor blood vessels for drug delivery, factors involved, and limitations and augmentation of the effect. Adv Drug Deliv Rev. 2011 Mar 18;63(3):136-51.
3. Maeda H, Wu J, Sawa T, Matsumura Y, Hori K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Release. 2000 Mar 1;65(1-2):271-84
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