腺相关病毒载体的关键质量属性表征与分析

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）因其温和的免疫反应，以及能将自身遗传物质导入至多种宿主细胞的能力，正成为基因治疗领域中非常重要的具有广泛应用前景的明星载体工具；为了确保基于基因载体的药物具有良好的安全性和有效性，在药物研究，工艺与过程开发，药物规模化生产的全过程中，必须使用稳定，准确以及可靠的表征分析工具。本文介绍了一种能在15-30min内，一次进样，同时表征AAV三大关键质量属性（CQAs）的强大分析技术-SEC-MALS：1. 衣壳蛋白颗粒数（Total number of viral capsid particles，Cp），基因颗粒数（Vg）; 2. 实心率（ration of full to total capsid）; 3. 聚集体比例;该方法创造性的将尺寸排阻色谱（SEC）串联18角度激光光散射检测器 (MALS) ，紫外检测器(UV)以及干涉型示差折光检测器 (dRI) 组成SEC-UV-MALS-dRI多检测系统。此外，该系统还可以在非破坏条件下直接测定AAV病毒载体分子量等信息；鉴于生物药物的复杂性，同一质量属性，通常需要至少三种基于不同原理的方法进行交叉验证，从而确保数据准确和可靠，因此本文同时介绍了另外两种重要，可用于交叉验证的病毒载体表征的技术手段：高通量动静态光散射技术（HT-DLS），非对称性场流分离技术(FFF)。经过四十多年的深入研究，衣壳蛋白和基因技术的突破性进步，使得重组腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus，rAAV）成为最受欢迎的基因治疗载体。迄今为止，超过200个AAV药物进入临床试验和3个上市药物(1)。随着衣壳蛋白和转基因的工程化改造提高转染效率和逃避与中和抗体结合，候选药物分子之后进入到产品，工艺与过程开发，临床试验，以及全面生产阶段，此时只有使用更好的分析工具才能更精确定量和表征这些新型的治疗性药物分子；而在定量和表征AAV载体方面，光散射技术在一次精准的检测试验中提供了强大的检测能力和独特的解决方案。18角度激光光散射检测器与尺寸排阻色谱联用技术（SEC-MALS）是一种常见的广泛应用于生物产业的产品研发，工艺与过程开发，放行检测等各各环节所需的绝对质量属性检测的强大通用型分析工具。通过配备同步多检测技术：18角度激光光散射检测器（MALS）, 紫外检测器（260nm和280nm）以及干涉型示差折光检测器（dRI），SEC-MALS系统一次进样，仅需15-30min即可轻松精确定量多个AAV关键的质量属性指标：总蛋白浓度（Cp），基因浓度（Vg），实心率（Vg/Cp），纯度/聚集体比例等(2)。传统需要依靠多种检测技术才能定量衣壳蛋白，而SEC-MALS不仅一次可以测定多个关键质量指标，而且还可以满足整个药物研发，工艺与过程开发，产品质量控制等环节的检测需求；更令人兴奋的点：与传统检测技术相比，SEC-MALS极大的提高了测量的准确度和精密度。例如2021年BioMarin的科学家Nicole L. McIntosh et al.在Nature上发表的文章中详细描述了SEC-MALS与传统技术检测结果比较：对于已知的Capsid浓度和不同的实心率样品（Vg/Cp）样品，SEC-MALS技术检测的结果误差低于5%；而采用SEC-UV（260nm/ 280nm比值）的检测结果误差大于50%。相似的低精密度的现象也表现在传统的检测技术（例如ELISA和qPCR）结果中(3,4)。SEC-MALS作为大分子溶液绝对分子量（绝对生物物理性质）测定的工业金标准是其强大的性能表现的根源。无需依赖任何试剂（染料）或间接测定（荧光技术），SEC-MALS直接测定关键的参数信息，继承SEC-UV的已优化色谱条件，无需增加任何额外的时间成本和方法开发成本，即可深度表征样品理化性质。例如MALS结合dRI检测器即可获取绝对分子量信息，确认色谱峰中每个组分的“身份”，如单体，寡聚体，片段/碎片，或其它杂质等；该功能可以应用于数据分析中的内部控制和不同进样次数间的结果比较。通过dRI定量聚集体的含量可以消除UV检测（260, 280nm）时因散射而导致的检测误差（当粒径增加到一定程度时，低波长也可以发生散射现象）。同时结合UV和dRI检测技术，可以精准的测定Capsid在指定波长下的紫外消光系数；从而获取准确的AAV浓度和实心率。为了在QC放行检测中简化操作，快速定量，深度表征以及流水化分析操作的需求，可以使用MALS和UV检测（260, 280nm）进行检测。所有这些分析检测无需做任何调整即可满足不同血清型的AAV样品。

其它作为SEC-MALS互补性的方法包括18角度激光光散射-场流分离检测系统（FFF-MALS）和高通量动静态光散射仪（HT-DLS）。这些分析方法进一步扩展了AAV样品的表征范围，满足作为交叉验证方法的需求(Table 1)。FFF-MALS技术可以定量和表征更高的聚集体组分，而这些组分在传统的SEC分析条件下，极可能被色谱填料剪切和截留。常应用于因条件变化导致的样品的聚集体形成或其它杂质的鉴定(5)。高通量动静态光散射仪（HT-DLS）采用工业化微孔板载样（96/384/1536），能快速的扫描粒径，粒径分布，总蛋白颗粒浓度，热稳定性以及胶体稳定性等，应用于早期分子稳定性评估，纯化工艺优化，冻干工艺优化，制剂筛选，下游工艺优化以及尺度表征等(6)。

试验内容

SEC-MALS数据使用标准的高效液相色谱按照SOP Guidance Manual: Critical Quality Attributes of AAV by SEC-MALS (Wyatt Technology Corporation) (7)方法采集。Table 1详细描述了系统的硬件需求，灵敏度规格以及典型的方法参数。系统由高效液相色谱泵，自动进样器，二极管阵列检测器（Agilent Technologies）以及18角度激光光散射检测器（DAWN MALS）干涉型示差折光检测器（Optilab dRI）（Wyatt Technology Corporation）组成；分离使用的SEC色谱柱为WTC050S5，300x4.6mm（Wyatt Technology Corporation）；所有数据的采集和分析通过Astra软件中的viral vector analysis获取（Wyatt Technology Corporation）。

结果与讨论

总蛋白颗粒浓度（Cp）：SEC-MALS满足在超宽广浓度范围内的蛋白颗粒浓度的准确测定。不同进样次数间的结果精准度优于5%，与起始的AAV浓度无关。在最优的色谱条件下，可以达到1%的精准度。Figure 1(a)显示了进样体1-50ul条件下，测量蛋白浓度8×1010cp/ mL ~ 8×1013cp/mL范围具有良好的线性，准确度，精密度；通过进样体积和浓度的改变，测定总的蛋白颗粒浓度，理论值与测定值具有同等的高精密度。如Figure 1(b)所示，这些结果与传统技术具有更多便利性和优势。鉴于自动化和复杂样品无需制备特点，SEC-MALS分析技术适用于产品和过程控制的整个生命周期；

实心率（Full-to-total Ratio ，Vg/Cp）：空心和实心AAV具有相同的流体力学半径（Rh），SEC无法从病毒颗粒中分离出空心AAV；因而，分离无法定量实心率（Vg/Cp）。采用同步多检测技术获取的数据用于计算色谱图上每一组分对应的蛋白和核酸的绝对含量；Figure 2显示将已知空心和实心AAV样品按照一定比例混合，获取不同Vg/Cp值，其范围：0.03 ~ 0.97；总浓度~5×1012particles/mL；每一混合物的测定值（Vg/Cp）偏差优于±0.03；该测定结果与ddPCR和AUC方法测定的准确度和精密度一致；

通过MALS技术测定病毒载体的绝对分子量进一步增强了Vg/Cp的准确性；如图Figure 2(b)所示，SEC-MALS不仅可以测定总分子量，而且还可以测定衣壳蛋白和DNA的分子量；无论Vg/Cp值是多少，通过MALS测定的蛋白分子量直接反映了衣壳蛋白的分子量。该测定值可以扮演内部控制的角色，确保分析结果的一致性和完整AAV表征，而仅采用SEC-UV方法无法做到这点；测定的蛋白分子量与理论分子量间的偏差揭示了蛋白亚基组装的错误，蛋白聚集，片段形成，或者蛋白降解；这些数据结合物理滴度（Vg）以及蛋白含量，应用于生产重组腺相关病毒产品许多环节的一致性评估，或细胞株评估，以及优化生产策略等 (8)。

   DNA分子量的测定可应用于产品批间差异评估（lot-to-lot）或包装效率的变化分析（如图Figure 2b所示）。具有较高包装效率的AAV样品显示测定的DNA分子量与转入基因大小接近或一致；而空心的AAV中的DNA分子量几乎可以忽略；包装了多个单一的转入基因的拷贝（Copies），例如自身互补型DNA，将会导致测定的DNA分子量高于设计值；通过直接测定包装的DNA分子量，SEC-MALS提供更为精准的Vg/Cp结果；而此种情况下，qPCR测定的滴度结果很可能具有巨大误差(4)。

聚集体以及更多表征信息

SEC用于快速分离AAV样品的单体，寡聚，片段/碎片；而SEC-MALS技术是确证寡聚，聚集体，以及其它杂质的核心技术手段。通过测定每一组分的分子量和尺寸，识别二聚，三聚体，更大聚集体，片段/碎片(Figure 3)，以及每一组份的相对含量。传统技术SEC-UV检测更大聚集体时，因散射效应，而导致过高估计聚集体比例；相比之下，MALS和dRI检测器可以更准确定量聚集体比例；SEC–UV–MALS-RI数据可以识别不含AAV的组分信息，例如加速试验中游离的DNA信息(3)。

  互补性的，交叉验证的光散射技术测量方法可以确证样品纯度，助力SEC-MALS方法系统适应性方法建立。动态光散射技术（DLS）可以快速，低体积消耗，非破坏性的检测特点可以满足工艺与过程开发，QC中粒径的检测以及估算蛋白颗粒浓度(6)。MALS，UV和dRI与场流分离技术结合（FFF-MALS）针对更高聚集体组分进行更为广泛和深入的表征与定量；而这些组分往往在色谱填料中被吸附，截留或剪切；因此，结合光散射技术工具，提供多种方法完整分析和表征AAV样品的关键质量属性。

结 论

SEC-MALS技术可以一次，快速和自动测定AAV的多个关键质量属性。与传统的SEC, ELISA以及qPCR相比，具有更高的精准度(3,4)。此外，该技术无需额外的特殊试剂，样品制备，适用于各种血清型AAV样品，从而轻松从产品开发阶段转移到QC阶段以及生产过程中。因此，SEC-MALS技术正成为分析表征和定量AAV基因治疗领域的新的金标准。

文章来源：

求实药社

翻译自：

https://www.chromatographyonline.com/view/quantifying-aav-quality-attributes-using-sec-mals

参考文献

[1] J.T. Bulcha, Y. Wang, H. Ma, P.W.L. Tai, and G. Gao, Signal Transduct. Target. Ther.6, 53 (2021).

[2] M. Chen and A. Purchel, “AN1617: Quantifying quality attributes of AAV gene therapy vectors by SEC-UV-MALS-dRI”, https://www.wyatt.com/ library/application-notes/an1617-aav-critical- quality-attribute-analysis-by-sec-mals.html (2019).

[3] N.L. McIntosh, G.Y. Berguig, O.A. Karim, C.L. Cortesio, R. De Angelis, A.A. Khan, D. Gold, J.A. Maga, and V.S. Bhat, Sci. Rep. 11, 3012 (2021).

[4] P. Fagone, J.F. Wright, A.C. Nathwani, A.W. Nienhuis, A.M. Davidoff, and J.T. Gray, Hum. Gene Ther. Methods23(1), 1–7 (2012).

[5] C. Deng, “AN2003: Quantifying AAV aggregation and quality attributes by FFF-MALS”, https://

www.wyatt.com/library/application-notes/ an2003-quantifying-aav-aggregation-and-quality- attributes-by-fff-mals.html (2020).

[6] X. Zhang, W. Wang, and S. Kenrick, “AN5007: Characterization of AAV-based viral vectors by DynaPro DLS/SLS instruments”, https://www. wyatt.com/library/application-notes/an5007-aav- quantitation-and-stability-analysis-by-batch-dls.html (2019).

[7] Wyatt Technology Corporation, “SOP Guidance Manual: Critical Quality Attributes of AAV by SEC- MALS” (2020).

[8] N. Selvaraj, C.-K. Wang, B. Bowser, T.L. Broadt, S. Shaban, J. Burns, et al., Hum. Gene Ther. Methods PMID: 33397196 (2021). doi: 10.1089/hum.2020.054.

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