2021年6月，基因编辑技术CRISPR/Cas最新研究进展
基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。2020年10月，德国马克斯-普朗克病原学研究所的Emmanuelle Charpentier博士以及美国加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna博士因在CRISPR-Cas9基因编辑方面做了的贡献荣获2020年诺贝尔化学奖。
CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。
图片来自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。
2018年11月26日，中国科学家贺建奎声称世界上首批经过基因编辑的婴儿---一对双胞胎女性婴儿---在11月出生。他利用一种强大的基因编辑工具CRISPR-Cas9对这对双胞胎的一个基因进行修改，使得她们出生后就能够天然地抵抗HIV感染。这也是世界首例免疫艾滋病基因编辑婴儿。这条消息瞬间在国内外网站上迅速发酵，引发千层浪。有部分科学家支持贺建奎的研究，但是更多的是质疑，甚至是谴责。
刚刚过去的6月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢？小编梳理了一下6月份生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。
1.Science子刊：利用脂质体纳米颗粒递送靶向IL1RAP基因的CRISPR/Cas9，可让白血病干细胞无处可逃
doi:10.1126/sciadv.abg3217
急性骨髓性白血病（AML）是一种侵袭性的血癌，只有28%的AML患者能够存活5年。作为一种异质性血液恶性肿瘤，AML以异常增殖和分化受损为特征，是成人急性白血病的主要类型，在美国所有白血病亚型中死亡人数最多。
在一项新的研究中，来自美国和韩国的研究人员开发出一种攻击白血病的最新方法，该方法有点像消灭蟑螂。它是一个三步骤过程：使用尖端技术诱导、诱捕和杀死白血病细胞的根源：白血病干细胞（leukemia stem cell, LSC），又称为白血病起始细胞（leukemia-initiating cell, LIC）。这一发现对于治疗AML患者具有重要的临床意义。相关研究结果近期发表在Sciences Advances期刊上，论文标题为“Scaffold-mediated CRISPR-Cas9 delivery system for acute myeloid leukemia therapy”。
Cas9 RNP递送系统原理图，图片来自Science Advances, 2021, doi:10.1126/sciadv.abg3217。
这些作者开发的这种新方法使用可以编辑细胞内基因的CRISPR/Cas9技术。具体而言，他们使用一种生物还原性脂质体封装的Cas9/单向导RNA（sgRNA）核糖核蛋白[脂质体纳米颗粒（LNP）-Cas9 RNP]来靶向人类LSC中的关键基因：白细胞介素-1受体辅助蛋白（IL1RAP）。为了增强对LSC的靶向性，他们将LNP-Cas9 RNP和趋化因子CXCL12α装载到模拟骨髓微环境的涂有间充质干细胞膜的纳米纤丝（mesenchymal stem cell membrane–coated nanofibril, MSCM-NF）支架上。
在体外，CXCL12α释放诱导LSC迁移到MSCM-NF支架上，LNP-Cas9 RNP就高效地对LSC中的IL1RAP基因进行编辑，从而实现IL1RAP基因敲除。IL1RAP基因敲除会降低LSC集落生成能力和白血病负荷。基于MSCM-NF支架的递送可增加LNP-Cas9在骨髓腔中的停留时间。总之，通过装载CXCL12α的LNP/MSCM-NF支架局部持续递送Cas9/IL1RAP sgRNA提供了一种高效减少LSC生长的策略，从而改善AML疗法。
2.NEJM：科学家进行首个人类临床试验利用CRISPR-Cas9基因魔剪来剔除编码甲状腺素运载蛋白淀粉样变性的基因
doi:10.1056/NEJMoa2107454
转甲状腺素淀粉样变性（Transthyretin amyloidosis）又称为ATTR淀粉样变性，其是一种威胁患者生命的疾病，主要特点表现为错误折叠的转甲状腺素蛋白（TTR）在组织中逐渐积累，主要表现为神经组织和心脏组织。NTLA-2001是一种体内进行基因编辑的治疗性制剂，其主要通过降低血清中TTR的浓度来治疗ATTR淀粉样变性，其基于CRISPR-Cas9而被开发，主要包括一个包裹编码Cas9蛋白的信使RNA的脂质纳米颗粒和一个靶向作用TTR的单一导向RNA分子。
近日，一篇发表在国际杂志New England Journal of Medicine上题为“CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis”的研究报告中，来自英国伦敦大学学院等机构的科学家们通过研究进行了首个涉及在体内利用CRISPR对人类基因编辑的临床试验；文章中，研究者所开发的这种CRISPR技术能帮助治疗ATTR淀粉样变性患者，同时研究人员还对6名患者注射了名为NTLA-2001的疗法以作为1期临场试验的一部分。
这种疗法由携带基因组编辑器至肝脏的脂质纳米颗粒组成，该过程的读一部分涉及对所有编辑的基因进行指导，而第二部分则涉及利用RNA信息来传递进行基因编辑。在试验中，患者被分为多组，每一种都接受不同剂量的NTLA-2001疗法，随后对患者进行测试的结果显示，那些接受0.1mg剂量疗法的患者机体中TTR蛋白的水平下降了52%，而接受0.3mg剂量的患者机体中TTR的水平则平均下降了87%。
3.Sci Adv：新型药物分子或能杀灭并限制肠癌细胞的再生和进展
doi:10.1126/sciadv.abf2567
肠癌是澳大利亚普通人群第二大致命性的癌症，每周大约都有300名澳大利亚人被诊断为这类癌症，而且有超过100人会死于这种疾病；在澳大利亚，女性患肠癌的风险大约为8%，而男性则为10%。Wnt/β-连环蛋白的异常激活或许是结直肠癌生长的关键驱动因素，而且在临床上具有重要的治疗意义。
近日，一篇发表在国际杂志Science Advances上题为“Genome-scale CRISPR-Cas9 screen of Wnt/β-catenin signaling identifies therapeutic targets for colorectal cancer”的研究报告中，来自哈德逊医学研究所等机构的科学家们通过研究发现，正在试验的一种白血病药物或有望帮助抵御肠癌。
基因组级别的CRISPR筛选结果表明，人工TOP-GC报告基因活性与β-catenin内源性靶点的转录之间存在差异。图片来源：Chunhua Wan，et al. Science Advances (2021). DOI:10.1126/sciadv.abf2567
本文研究中，研究人员在全球首次利用诺贝尔医学或生理学奖得主所开发的CRISRP基因编辑技术进行研究后发现，一种白血病药物或有望帮助抵御肠癌。文章中，研究人员利用CRISRP技术识别了肠癌肿瘤的新型靶点，这时候他们发现了一种与急性髓性白血病相关的基因KMT2A或能促进肠癌进展，其会通过促进肿瘤的失控生长来发挥作用，同时还能推动癌细胞进行自我更新，并抑制肿瘤的消退或分化。
随后研究者利用两种抑制KMT2A基因表达的制剂进行了相关研究，结果发现，这些药物能阻断肠癌生长和自我更新，但同时对正常细胞的损伤较小；这些抑制剂与目前在临床上使用的用于治疗白血病的制剂非常相似。研究者Chunhua Wan说道，靶向作用KMT2A基因或能逆转肠癌细胞的侵袭性和攻击性，并能重新对其进行教育来使其转变为正常细胞。
4.Nat Commun：基因组研究或能揭示潜在的组合性疗法或能有效治疗三阴性乳腺癌
doi:10.1038/s41467-021-23316-4
乳腺癌是全球女性因癌症死亡的主要原因，每天全球都有大约1700人因该病而死亡；尽管绝大多数乳腺癌都是可以治疗的，但最具侵袭性的乳腺癌亚型—三阴性乳腺癌（TNBC）具有较高的复发率、转移潜力大，且往往会对常规疗法产生一定的耐受性，从而导致患者预后和生存质量较差。近日，一篇发表在国际杂志Nature Communications上题为“In vivo genome-wide CRISPR screen reveals breast cancer vulnerabilities and synergistic mTOR/Hippo targeted combination therapy”的研究报告中，来自麦吉尔大学健康中心等机构的科学家们通过进行一项临床前研究发现，一种新型的靶向性组合性疗法或能有效降低转移性乳腺癌患者的肿瘤生长，相关研究结果有望帮助开发治疗三阴性乳腺癌的新型一线靶向性疗法，并有望迅速过渡到人体的临床试验阶段。
研究者Jean-Jacques Lebrun说道，目前针对三阴性乳腺癌并没有靶向性疗法，化疗治疗甚至还会使得这些肿瘤富含癌症干细胞，且会对患者带来不利影响，正如我们在此前研究中观察到的那样。虽然大多数乳腺癌都有三种常见的主要受体中的一种，这就好像疗法的入门闸口一样，即雌激素受体、孕激素受体和一种称之为人类表皮生长因子受体（HER2）的蛋白质，但三阴性乳腺癌并没有上述三种受体，这类乳腺癌亚型因此而得名；利用诸如基因编辑和全基因组分子方法，研究人员识别出了两种通路或能在治疗性策略中被靶向作用。
研究人员的研究发现超出了他们的预期，这两种药物能以协同的方式来发挥作用，而且利用细胞和患者机体衍生的异种移植模型进行研究后他们发现，这两种药物或能有效减少肿瘤在体内和体外的生长。实验中，研究人员注意到，维替泊芬或能通过细胞凋亡来诱导细胞死亡，而另一方面Torin1则是通过一种非细胞凋亡的机制—巨胞饮（macropinocytosis）的过程来诱发细胞死亡，巨胞饮是一种被称为“细胞饮水”的内吞过程，其能允许细胞外的所有营养物质和液体内吞入细胞，最终导致细胞内爆以及灾难性的细胞死亡。
5.Nature：重大进展！利用碱基编辑让致病性血红蛋白无害化，有望治疗镰状细胞病
doi:10.1038/s41586-021-03609-w
人体内的血红蛋白是红细胞中运输氧气的特殊蛋白质，由珠蛋白和血红素组成。珠蛋白含有4个亚基（α2β2），每个亚基连接1个称为血红素的辅基分子。血红蛋白基因（HBB）的点突变导致异常血红蛋白的产生。已发现数百种异常血红蛋白，其中只有一小部分引起疾病发生，最常见也最了解的疾病是镰状细胞病（SCD）。SCD是一种常见的致命性常染色体隐性遗传病，由HBB基因突变引起。这种疾病每年影响全世界30多万名新生儿。它导致了患者的慢性疼痛、器官衰竭和早期死亡。
在一项新的研究中，由来自美国布罗德研究所和圣犹大儿童研究医院的研究人员领导的一个研究团队证实一种碱基编辑方法能够高效地校正患者造血干细胞中和小鼠体内导致SCD的基因突变。这种基因编辑治疗利用碱基编辑将致病性的血红蛋白基因转化为良性的基因变体，挽救了SCD动物模型中的疾病症状，使健康的血细胞得以持久地产生。相关研究结果于2021年6月2日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice”。
HBBS→HBBG碱基编辑减轻小鼠SCD模型的病理。图片来自Nature, 2021, doi:10.1038/s41586-021-03609-w。
SCD的根源是患者携带血红蛋白基因HBB的两个突变拷贝。这两个突变拷贝导致红细胞从圆盘状转变为镰刀状，引发一连串事件，最终导致器官损伤、复发性疼痛和早期死亡。在这项研究中，这些作者使用了一种称为碱基编辑的分子技术，在人类造血干细胞中和SCD小鼠模型体内直接将致病性的HBB基因（HBBS）转换成无害的望加锡（Makassar）HBB基因变体（HBBG）。
论文共同通讯作者、布罗德研究所梅金医疗转化技术研究所主任、哈佛大学教授、霍华德-休斯医学研究所研究员David Liu说，“我们能够在细胞模型和动物模型中使用定制的碱基编辑器来校正致病性的基因变体，而不需要诱导双链DNA断裂或在基因组中插入新的DNA片段。这是一项重大的团队努力，我们希望碱基编辑将为SCD治疗策略提供一个有希望的基础。我们的研究说明了多学科合作在开发基于机制的新型遗传疾病治疗方法方面的力量和和兴奋点。特别是，我们结合了蛋白质工程、碱基编辑和红血球生物学方面的专业知识，从而构建出一种治疗和可能治愈SCD的新方法。”
6.Science：中美科学家揭示耶尔森菌感染诱导宿主细胞焦亡机制
doi:10.1126/science.abg0269
致病菌采用了多种策略来破坏宿主的先天免疫信号以促进其感染。以前的研究显示，耶尔森菌效应蛋白YopJ靶向并抑制TAK1（transforming growth factor-β–activated kinase 1, 转化生长因子-β活化激酶1）以阻止促炎性细胞因子的产生。为了反击，宿主细胞通过启动RIPK1（receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1, 受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1）依赖性的caspase-8引导的gasdermin D（GSDMD）裂解而触发细胞焦亡（pyroptosis）。然而，RIPK1-caspase-8-GSDMD轴在耶尔森菌感染期间如何被指导仍然是未知的。
在一项新的研究中，来自中国科学院、中国科学院大学、美国波士顿儿童医院和哈佛医学院的研究人员通过无偏见的CRISPR筛选发现了溶酶体膜驻留的Rag-Ragulator复合物在耶尔森菌感染触发的细胞焦亡中的关键和意外作用。相关研究结果发表在2021年6月25日的Science期刊上，论文标题为“The lysosomal Rag-Ragulator complex licenses RIPK1– and caspase-8–mediated pyroptosis by Yersinia”。
这些作者发现，Rag-Ragulator复合物成分的缺失使得宿主细胞不能应对耶尔森菌感染诱导的细胞焦亡，这表明Rag-Ragulator复合物在caspase-8介导的细胞焦亡中发挥着重要作用。此外，他们发现，在感染致病性耶尔森菌或其模拟物（脂多糖加TAK1抑制剂）后，含有FADD-RIPK1-caspase-8的复合物通过Rag-Ragulator复合物被招募到溶酶体膜，这一过程取决于Rag GTP酶的活性和Rag-Ragulator的溶酶体结合，但不取决于Ragulator激活的mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1）。
这项研究揭示了Rag-Ragulator在耶尔森氏菌感染期间由TAK1抑制诱导的细胞焦亡中的关键作用。Rag-Ragulator在caspase-8介导的细胞焦亡中的新作用证实了它作为监测环境线索的中心枢纽的关键功能，这不仅决定细胞是否增殖，也可以决定细胞是否存活。
7.Nat Med：工程化的酵母益生菌或有望帮助治疗人类炎性肠病
doi:10.1038/s41591-021-01390-x
炎性肠病（IBD，Inflammatory bowel disease）是机体胃肠道的一种复杂慢性炎性障碍，由机体共生微生物和宿主细胞所产生的胞外三磷酸腺苷（eATP）能够激活嘌呤信号，并促进肠道炎症和病理学表现。生活在人类肠道中的微生物世界会对人类健康产生深远的影响，包括炎性肠病在内的多种疾病都与这些微生物的平衡有关，这表明，恢复微生物菌群正确的平衡或能帮助治疗疾病，目前市场上的许多益生菌（包括活的酵母菌和细菌）已经在健康肠道的背景下通过进化得到了一定的优化；然而，为了治疗诸如炎性肠病等复杂的人类疾病，研究人员就需要利用益生菌来发挥多种功能，包括关闭炎症的能力、逆转损伤且恢复肠道微生物组的功能。近日，一篇发表在国际杂志Nature Medicine上题为“Self-tunable engineered yeast probiotics for the treatment of inflammatory bowel disease”的研究报告中，来自多伦多大学等机构的科学家们通过研究开发了一种“设计者益生菌”，这种经过改造的工程化酵母菌或能帮助诱导多种治疗炎性肠病的多种效应。
这篇研究报告中，研究人员利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)开发了特殊的益生菌，在基因魔剪CRISPR/Cas9的帮助下，研究人员引入了能感知炎症并对其产生反应的遗传元件，其能通过分泌特殊酶类来降解参与机体炎症发生的关键分子。这种工程化的酵母菌能分泌多种水平的酶类，这主要取决于肠道某个位置所存在的炎性信号的水平，这就意味着这种益生菌或许会对炎症产生一种高度局部化的反应；在小鼠机体中，这种工程化的酵母菌能成功抑制肠道炎症，并降低纤维化发生且能恢复肠道微生物组的平衡。
为了将这种新型治疗性平台引入用以治疗炎性肠病和其它人类疾病，研究者Quintana及其同事就需要进行安全性研究；下一步他们计划不断优化并检测这种工程化的酵母菌是否能加速机体的组织修复（除了治疗炎性肠病外），目前研究者们正在调查是否能利用工程化的益生菌来治疗癌症免疫疗法所产生的副作用—结肠炎。研究人员想利用这种合成生物学工具设计出在自然界能够找到的东西；通过对益生菌进行工程化修饰，研究者旨在产生更多个体化、局部化且高度受控的疗法来治疗肠道及其以外组织所出现的疾病。
8.Theranostics：血清素/HTR1E信号阻断慢性应激促进的卵巢癌进展
doi: 10.7150/thno.58956
许多流行病学和临床研究表明，心理应激与癌症的发展和对治疗的抵触有关。应激激素，尤其是糖皮质激素诱导的免疫抑制微环境已被广泛研究。然而，其他与应激相关的神经递质，如5-羟色胺(5-羟色胺，5-HT)，对癌症发展的影响才刚刚开始显现。在本研究中，作者的目的是确定新的神经递质参与应激诱导卵巢癌(OC)的生长和扩散，并揭示主要的潜在信号通路和治疗意义。最终作者发现了5-羟色胺/HTR1E信号在预防慢性心理应激促进的OC进展中的重要作用，提示HTR1E特异性激动剂和SRC抑制剂对遭受心理应激的OC患者有潜在的治疗价值。
HTR1E介导的5-羟色胺信号通路在预防OC进展中的示意图，图片来源：https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
在原位OC小鼠模型的全基因组CRISPR/Cas9基因敲除筛选中，作者发现一个5-羟色胺受体，即HTR1E，位于前十个候选基因之列。本研究将应激模型与卵巢癌原位小鼠模型相结合，揭示了HTR1E介导的5-羟色胺下游信号转导在抑制卵巢癌生长和腹膜播散中的重要作用，为应激促进卵巢癌进展提供了新的机制。
在卵巢5-羟色胺的GPCRs中，HTR1E的高表达与致癌的SRC信号负偶联，抑制SRC激活的下游通路，包括MEK-ERK、PI3K-AKT和FAK，最终导致抑制细胞的增殖、迁移和EMT过程，从而有利于OC的生长和扩散。慢性应激导致卵巢局部5-羟色胺减少或HTR1E表达减少将减弱HTR1E对SRC激活的抑制作用，导致OC生长和扩散增加。用特异性HTR1E激动剂或特异性SRC抑制剂重新激活5-羟色胺/HTR1E信号是抑制慢性应激促进的OC生长和扩散的一种有前途的策略。
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