文献速递 | 提升AAV产率新策略，利用CRISPR-dCas9进行全基因组基因转录激活筛选潜在靶标
HEK293细胞系及生产AAV的其它细胞系，最初并不是作为AAV载体生产而改造建立的，所以这些细胞系可能有很大的改造空间来提高AAV的产率，由于AAV病毒基因组复制及包装机制过于复杂等因素，其改进AAV生产细胞的合理设计充满挑战。借鉴衣壳进化策略中采用的高通量文库的筛选方法，也许可以筛选出靶点来改造生产AAV的细胞，提高AAV产率，最终降低生产成本。
为此，研究人员开发了一种全基因组基因转录激活筛选策略，来鉴定可提高AAV载体产率的候选基因。大致原理是：将基于 CRISPR 的全基因组转录激活筛选的sgRNA文库插入 AAV 载体中，并在 HEK293 生产细胞中反复进行病毒感染和病毒拯救，从而富集特异性sgRNA（见图1）。通过这种方法鉴定出了一些候选基因，例如纺锤体和动粒相关复合亚基 2 (SKA2)基因、肌醇 1, 4, 5-三磷酸受体相互作用蛋白 (ITPRIP)基因等。其研究成果以《Genome-wide activation screens to increase adeno-associated virus production》为题，近期在线发表在《Molecular Therapy-Nucleic Acids》（IF=8.886）杂志上。
图1. 利用CRISPR-dCas9进行全基因组基因转录激活筛选提高AAV产率靶基因流程图
基于 CRISPR 的转录激活技术采用切割活性缺失的dCas9蛋白融合VP64转录激活蛋白，加上起靶向定位作用的gRNA，在 gRNA 介导下可特异性识别并结合靶标基因的启动子，引起靶标基因转录激活（见图2）。
图2. dCas9-VP64转录激活示意图
进一步实验表明：不仅通过CRISPR-dcas9 转录激活SKA2和ITPRIP的表达可以提高AAV产率，而且通过导入外源cDNA过表达上述基因也能够提高AAV产率近3倍，而且，将两个靶基因表达量同时提高可以将AAV产率提高4倍（见图3）。此外，优化后的生产系统生产的AAV过程中期AAV基因组复制提高了，生产出的AAV病毒粒子空壳率降低了，这些变化可能是由于细胞周期被改变导致的。
图3
SKA2作为细胞分裂中期和后期过渡过程中染色体有效分离必需复合物的组成部分，在纺锤体检查点沉默中发挥作用。AAVRep蛋白已被证明可以阻滞细胞分裂停留在S期（细胞分裂间期），在此期间发生AAV载体基因组复制。因为DNA复制在S期延迟有丝分裂的时间，延迟细胞进入有丝分裂期，并且研究发现纺锤体组装检查点激活发生在S期，因此，推测SKA2可能影响细胞周期检查点影响纺锤体组装检查点，进而增加AAV载体基因组的复制，导致AAV产率的提高。
图4. 细胞分裂示意图
ITPRIP已被证明通过与ITP受体相互作用来影响细胞内钙的释放，ITPRIP与内质网(ER)膜中的ITP受体结合，增强其对细胞内钙信号的敏感性，此外，ITPRIP定位于细胞核核膜，因此，推测其可调控核钙水平，胞内钙信号可调节细胞周期和DNA损伤反应。因此，ITPRIP可能是通过调节细胞内或核内钙离子水平来提升AAV的产量和质量。
除了其产率，AAV生产还面临着另外一个棘手的问题，就是制品中空衣壳的去除。空衣壳的存在一方面会增加AAV制品的免疫原性，一方面还会干扰完整的AAV颗粒的转导。虽然密度梯度超速离心可以去除空壳，但是此工艺不易应用于AAV规模化纯化制备；离子交换色谱法可以减少空衣壳占比，但不能完全消除。本研究显示：单独过表达ITPRIP，尤其是是联合SKA2的过表达或表达上调，使完整衣壳的比例分别从40%增加到60%或90%（见图5），其具体机制有待进一步研究。
图5
总之，这种全基因组高通量筛选结果表明，可以通过调节宿主细胞靶基因表达来增强病毒产率，提升病毒载体质量。此外，通过这种方法筛选出调节病毒基因组复制或病毒包装相关的宿主基因，可增进人们对病毒复制包装机制的理解，为优化病毒载体生产系统的合理设计提供有价值的数据。
参考资料：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2162253121001700
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