科研 | Environ Pollut . ：如何提高苜蓿对镉胁迫的抗性？（国人佳作）
编译：微科盟阿昊，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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论文ID
原名：Improvement of alfalfa resistance against Cd stress through rhizobia and arbuscular mycorrhiza fungi co-inoculation in Cd-contaminated soil译名：根瘤菌和丛枝菌根真菌联合接种提高了苜蓿对镉胁迫的抗性
期刊：Environmental Pollution
IF：6.792发表时间：2021.05通讯作者：方临川通讯作者单位：中国科学院水利部水土保持研究所
实验设计
实验结果
1. 根际土壤理化性质
双因素方差分析结果表明，Cd、接种处理及其交互作用对NO3--N、NH4+-N、SOC和AP的含量皆有显著影响（P<0.05）。除了土壤pH外，在Cd处理后的土壤中，SOC含量，SOC:TN和SOC:TP都显著高于CK，同时接种两种微生物显著增加了NH4+-N和AP含量。
2. 植物生理特性与对Cd的吸收
接种微生物显著提高了苜蓿的地上部和根系生物量，而Cd的添加显著降低了苜蓿的地上部和根系生物量（P<0.01）。在添加Cd的根瘤菌和AMF共接种处理中，苜蓿生物量最高（3.35±0.116 g pot−1）。此外，Cd的添加量、接种量及其交互作用对苜蓿地上部和根系中Cd含量有显著影响。接种和Cd处理显著提高了苜蓿地上部和根系对Cd的吸收量（表1）。各处理根中Cd含量均高于对照（P<0.05）。此外，接种处理（即AR、AM和ARM）的Cd浓度均比对照（A）高1.2倍。在添加Cd的共接种处理中，总Cd吸收量最高（30.6±1.81 μg pot-1）。添加Cd后，单次接种和共接种处理的总Cd吸收量显著高于对照（P<0.05）。根瘤菌和AMF共接种处理的Cd总吸收量在单接种和非接种处理中最高。
表1 生物量、Cd含量和Cd在植物组织中的富集
注：A（苜蓿）、AR（苜蓿+根瘤菌）、AM（苜蓿+丛枝菌根真菌）、ARM（苜蓿+根瘤菌+丛枝菌根真菌）。CK和Cd分别代表对照土和添加Cd土。数值是三个重复土芯的平均值（±标准误差）。∗∗，P<0.001；∗∗，P<0.01；∗，P<0.05。
接种微生物后，地上部和根系的抗氧化能力显著提高，其中AR、AM和ARM处理的抗氧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性均显著高于A处理（P<0.05；表2）。根瘤菌和AMF共接种处理的苜蓿SOD、CAT和POD活性均高于未接种和单接种处理。例如，与A处理相比，ARM处理的枝条SOD活性提高了1.4倍。AR、AM和ARM处理的地上部MDA含量显著低于A处理（分别为27.28%、21.81%和34.09%）（P<0.05；表2）。此外，与未接种的对照植物相比，共接种处理的MDA、H2O2和O2-含量最低。
表2 不同处理下植物新梢丙二醛（MDA）、活性氧（O2-、H2O2）和抗氧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）含量的变化
3. 根际微生物群落的α多样性
所有土壤样品共鉴定出4847280个高质量的微生物序列，其中真菌序列2593280个，细菌序列2254000个，在97%的相似性界限水平上可分别聚类为904个OTU和197个OTU。对于细菌群落，添加Cd、接种及其相互作用均显著影响OTU、ACE、Chao1指标、Simpson和Shannon-Wiener指标（P<0.05；图1）。尤其是Cd的加入，大大降低了接种处理下细菌的Simpson多样性指数。添加Cd显著降低了细菌的Simpson多样性指数，而对照处理则提高了细菌的Simpson多样性指数。在真菌群落中，Cd的添加、接种及其交互作用对Chao1指数和Simpson多样性指数均有显著影响。尤其是Cd的添加显著增加了所有接种处理下真菌的Simpson多样性指数（P<0.05；图1）。添加Cd处理和对照处理均显著提高了真菌的Simpson多样性指数。
图1 不同处理间细菌（A，B），真菌（C，D）α多样性的差异
A（苜蓿）、AR（苜蓿+根瘤菌）、AM（苜蓿+丛枝菌根真菌）、ARM（苜蓿+根瘤菌+丛枝菌根真菌）。CK和Cd分别代表对照土和添加Cd的土壤。
4. 根际微生物群落结构
我们的研究在不同的处理中检测到10个相对丰度>1%的细菌门，即变形杆菌（Proteobacteria）、放线杆菌（Actinobacteria）、拟杆菌（Bacteroidetes）、厚壁菌（Firmicutes）、酸杆菌（Acidobacteria）、蓝藻菌（Cyanobacteria）、绿弯菌（Chloroflexi）、芽单胞菌（Gemmatimonadetes）、疣微菌（Verrucomicrobia）和Patescibacteria（图2A），相对丰度<1%的门被聚类为“Others”。拟杆菌门、放线杆菌门、变形杆菌门和厚壁菌门是所有处理的优势菌门。Cd的添加、接种及其相互作用显著影响厚壁菌、拟杆菌和酸杆菌的相对丰度。尤其是Cd的添加显著降低了所有接种（AR、AM和ARM）处理中放线菌的相对丰度，而增加了两种接种（AM和ARM）处理中厚壁菌的相对丰度。
图2 不同处理下优势细菌（A）和真菌（B）类群的相对丰度
图中字母分别代表：ACK（苜蓿）、ACd（苜蓿+Cd）、ARCK（苜蓿+根瘤菌）、ARCd（苜蓿+根瘤菌+Cd）、AMCK（苜蓿+丛枝菌根真菌）、AMCd（苜蓿+丛枝菌根真菌+Cd）、ARMCK（苜蓿+根瘤菌+丛枝菌根真菌）和ARMCd（苜蓿+根瘤菌+丛枝菌根真菌+Cd）。
我们的研究在不同的处理中检测到10个真菌门（相对丰度>1%），即子囊菌门、未分类的担子菌门、珠孢菌门、被子菌门、糜孢菌门、粘色菌门和尾蚴门（图2B）。所有处理的优势真菌门都是子囊菌门（44.3-65.7%）。Cd的添加显著影响了尾蚴和罗氏菌的相对丰度，接种显著影响了珠孢菌、被子菌和罗氏菌的相对丰度（P<0.05）。其他门占真菌群落组成的一小部分，如担子菌门和球孢菌门（表3）。双向方差分析表明，Cd的添加、接种及其相互作用显著影响细菌和真菌的群落结构（P<0.001；表S5）。此外，NMDS和ANOSIM分析表明，Cd和接种处理的真菌和细菌群落结构显著不同（P<0.001；图3）。
双尾方差分析（Two-way ANOVAs analysis）表明，Cd添加、微生物接种及其交互作用对细菌和真菌的群落结构均有显著影响（P<0.001）。NMDS和ANOSIM分析表明，Cd处理和接种处理的真菌和细菌群落结构差异显著（P<0.001；图3）。部分Mantel 检验进一步证实，添加镉和接种处理都与真菌和细菌群落内的差异性密切相关。
A（苜蓿）、AR（苜蓿+根瘤菌）、AM（苜蓿+丛枝菌根真菌）、ARM（苜蓿+根瘤菌+丛枝菌根真菌）。CK和Cd分别代表对照土和添加Cd的土壤。距离矩阵基于微生物OTU的相对丰度。
5. 微生物群落与土壤性质的关系
皮尔逊相关分析发现，细菌群落的Cd、OTUs和α多样性指标（即Shannon、Simpson、Chao1和ACE）之间存在显著相关性（P<0.05），土壤有机碳、总氮、总氮之间存在显著的相关性；然而，真菌群落的α多样性指标与这些土壤性质之间并没有显著的相关性。
VPA结果表明，土壤性质和Cd含量通常解释了细菌群落中的大部分变异（62.8%），而它们仅解释了真菌群落中12.9%的变异（图4A和B）。Mantel检验和相关分析表明，除TP和SOC:TP外，其它土壤指标均与细菌群落有显著相关，然而只有Olsen-P和pH对真菌群落有显著影响（图4C）。此外，RDA分析还证实，土壤变量对不同处理的细菌群落有更大的明显影响。根据相关热图和RDA分析，除TP外或CCA，细菌群落中的放线菌、拟杆菌、厚壁菌、酸杆菌和耐氯菌与土壤变量显著相关（P<0.05；图4D）。然而，在真菌群落中，只有壶菌门（Chytridiomycota）和隐真菌门（Rozellomycota）与大多数土壤变量显著相关（P<0.05；图4E）。
图4 变异分配分析表明，细菌群落（A）和真菌群落（B）解释了土壤性质和土壤Cd的变异百分比
土壤变量与微生物群落结构的关系。细菌类群（D门级）和真菌类群（E门级）与土壤性质的相关热图。用颜色梯度表示Spearman的相关系数，对环境因子进行两两比较。通过mantel检验，分类类群与各土壤变量相关。*相关性在P<0.05时显著（双尾）；*相关性在P<0.01时显著（双尾）；*相关性在P<0.001时显著（双尾）。
6. 接种和添加Cd处理与微生物群落、土壤性质、植物生物量和Cd吸收之间的关系
PLS-PM表明，接种根瘤菌和ARM直接影响真菌和细菌多样性，间接影响抗氧化酶活性、脂质过氧化和苜蓿生物量。接种对细菌多样性（OTU、ACE、Chao-1、Simpson和Shannon指标）有正向影响，但对真菌多样性无显著影响。接种正向影响抗氧化酶活性和苜蓿生物量，负向影响脂质过氧化（图5D）。接种对抗氧化酶活性（0.60）和植物生物量（0.55）的影响最大。
讨论
1. 根瘤菌与AMF共接种对Cd胁迫下植物抗性的影响
本研究发现，苜蓿生长4个月后生物量明显增加，根瘤菌和AMF处理的生物量最高（表1）。与未接种的处理相比，使用根瘤菌或AMF的单次接种处理伴随着生物量的增加和营养物质的获得。有的研究表明，接种AMF增加了豆科植物的根瘤数量，这表明菌根的形成提供了足够的磷（P）来支持根瘤和类杆菌的生长。在所有接种处理中，根瘤菌和AMF共接种处理对缓解苜蓿Cd胁迫的总体效果最大。
修复策略的可行性在很大程度上取决于土壤中残留重金属的生物活性及其在植物中的可用性。在根瘤菌和AMF共接种处理中，苜蓿地上部和根系对Cd的总吸收量显著高于单次接种和非接种处理（表1）。苜蓿地上部Cd含量保持稳定，说明接种可以防止Cd在植物组织中过量积累，同时提高植物生物量（表1）。此外，Cd主要在根中积累，极少量的Cd转移到地上部，这阻碍了地上部出现的Cd诱导毒性症状的发生，并随后有利于植物的稳定。
接种能促进苜蓿生长，提高苜蓿对Cd胁迫的抗性。接种后根系Cd含量显著增加（P<0.05；表1），但根中Cd含量的增加并没有导致地上部Cd含量的增加，也没有抑制苜蓿的生长，这进一步说明接种能提高苜蓿对Cd胁迫的抗性。我们的结果表明，接种后地上部和根系的ROS积累显著减少（表2）。ROS的产生和随后的氧化应激导致高MDA含量，这表明多不饱和脂肪酸的过氧化导致膜损伤。这意味着在所有接种处理中，H2O2和O2-的细胞调节特性减轻了Cd诱导的紫花苜蓿胁迫。接种后苜蓿根和茎中抗氧化酶活性（POD、CAT和SOD）的显著增加进一步表明了Cd胁迫的缓解（表2）。SOD活性的升高可归因于超氧自由基的增加，这是因为根瘤菌和AMF可以增强植物酶的从头合成。因此，植物中的高抗氧化酶活性可以保护细胞免受Cd胁迫引起的过量活性氧的损害。具体而言，与单次接种处理相比，共接种处理导致紫花苜蓿中的ROS含量显著提升，但相应的MDA含量最低（表2），这与共接种处理中最高的紫花苜蓿总生物量一致。与其他微生物接种试验（即中华根瘤菌和农杆菌）相比，根瘤菌和AMF分别作为细菌和真菌，具有有效结合调动N和P的优势，同时分泌激素促进植物抗性。因此，根瘤菌与AMF共接种可以促进植物SOD、CAT和POD活性，从而最大限度地消除ROS，从而帮助植物缓解Cd胁迫；多种共生微生物的联合接种可以帮助植物有效应对环境胁迫。
2. 根瘤菌与AMF共接种提高植物抗Cd能力的调控机制
探究根瘤菌与AMF共接种提高植物抗病性的途径是揭示接种促进生长机制的关键。在我们的研究中，接种微生物显著增加了Cd胁迫下紫花苜蓿根际细菌多样性，降低了真菌多样性，说明共接种有利于细菌群落多样性的恢复；而添加Cd则不利于真菌群落多样性的恢复（图1）。群落多样性反映了群落的稳定性和功能多样性，因此，与真菌群落相比，细菌群落对苜蓿抗Cd胁迫的辅助潜力更大。此外，PLS-PM还确定了Cd胁迫下细菌多样性对抗氧化酶活性和苜蓿生物量的显著正相关关系（图5）。
共接种显著影响细菌和真菌群落结构（图2和图3）。鉴于门水平上的微生物组合包含这些具有类似功能、代谢和形态特征的微生物类群，我们的研究专门探讨了微生物类群内的门（phylum）变化。共接种后，酸杆菌门、变形杆菌门、放线杆菌门和耐氯菌门的相对丰度显著增加，而拟杆菌和厚壁菌的相对丰度显著降低（图2A）。拟杆菌门和厚壁菌门是Cd污染下发现的关键类群，但它们不是根际接种处理后发现的关键门（表3）。考虑到许多病原体来源于拟杆菌门和厚壁菌门，变形菌门（如假单胞菌）的高丰度降低了病原体密度，同时降低了疾病发生率，这是由于资源竞争加剧和病原体干扰造成的，这支持了“变形菌门的增加可以抑制拟杆菌门和厚壁菌门的分类群繁殖能力”的假设。拟杆菌门和厚壁菌门可以在潜在的恶劣条件下生存，如酸性环境、害虫防治（即杀虫剂）措施和重金属污染，而这两个门在健康（非污染）环境中似乎没有竞争力。这些结果表明，添加Cd后，根际微环境得到改善。此外，类杆菌和厚壁菌相对丰度的降低可能会导致放线菌、酸杆菌和氯曲菌相对丰度的增加。
对于真菌类群，接种AMF后，格洛霉科菌（Glomeromycota）的相对丰度显著增加（AMF属于格洛霉科菌）（图2B）。另一方面，被子菌（Mortierellomycota）和罗氏菌（Rozellomycota）相对丰度的降低可归因于格洛霉科菌（Glomeromycota）相对丰度的增加。因此，在根瘤菌和AMF共同接种后，这些细菌类群和真菌类群可能是提高苜蓿抗Cd能力的关键根际微生物群。
共生微生物接种后紫花苜蓿对镉胁迫的抗性增加的相关机制可归因于通过共生微生物增强了整个根际环境。因此，本研究进一步探讨了微生物关键类群与土壤性质在苜蓿抗Cd改良中的关系。共接种后有效根际土壤养分的显著增加有助于植物养分的获取，从而改善其在镉胁迫下的生长。然而，必须注意的是，关键细菌类群的增加对土壤有机碳和土壤有效养分产生了负面影响，而关键细菌类群的减少对共接种后的这些变量产生了积极影响（图4）。说明共接种降低了苜蓿根际土壤有机碳和有效养分含量。有机分子的产生和分泌，如通过根系分泌的有机酸，是植物对胁迫的典型反应方式，可以反映出环境胁迫对植物的影响程度。根际土壤有机碳的含量主要来源于植物根系分泌物的产生，这是因为本次短期控制盆栽试验没有使用其他碳源。因此，根际土壤有机碳含量的降低可能表明苜蓿缓解了镉胁迫。此外，随着苜蓿生物量的增加，由于根系吸收养分，根际有效养分减少。
先前的研究表明，许多微生物类群，即变形菌、放线菌、酸杆菌和氯曲菌（例如，酸杆菌（GP1、GP3和GP6）、根瘤菌、伯克霍尔德菌、假单胞菌）可以帮助植物吸收养分并提高植物生产力。一项研究表明，根瘤菌可以提供疾病保护，因为提供营养的根瘤菌控制着由细菌属富集的三叶草的微生物群。此外，已知许多细菌可以缓解铁（Fe）、磷（P）、镁（Mg）和钙（Ca）的缺乏，这会阻止它们因重金属竞争而转移到植物根系。这些过程还可以通过增加根际微量元素的有效性来促进紫花苜蓿的生长。因此，提高紫花苜蓿对镉胁迫抗性的关键细菌类群的主要过程可能是它们帮助紫花苜蓿吸收根际养分并减少植物光合碳（C）释放到土壤中（图5）。
与细菌群落相比，VPA分析表明真菌群落对土壤变量的影响较小（图4A和B），这与我们的结果一致，即真菌群落除了Olsen-P和pH外，与根际的SOC和养分没有很强的相关性（图4C）。结果表明，真菌群落对提高苜蓿抗Cd胁迫能力的作用低于细菌群落，这些结果也得到了关键真菌类群和根际变量之间弱相关性的支持（图4E）。然而，AMF接种引起的这些关键真菌类群的变化强烈地影响了关键细菌类群，表明这些关键真菌类群可以通过影响细菌群落的方式在Cd胁迫下协助苜蓿生长中发挥间接作用。这些结果也揭示了根瘤菌和AMF联合接种比单独接种更能促进苜蓿抗性和生长的原因。通过分析PLS-PM（图5），关键真菌类群对关键细菌类群有直接影响，这对植物抗性和生长有间接的有益影响。一般来说，根瘤菌和AMF共接种处理下，根际细菌群落而不是相应的真菌群落主要提高了苜蓿对Cd胁迫的抗性。
偏最小二乘路径模型（PLS-PM）揭示了处理、微生物群落和土壤性质对植物抗性影响的主要途径（A）（B）；以及每个变量对植物生物量、抗氧化酶和脂质过氧化的总影响（C）（D）。（黄色和蓝色箭头分别表示因果关系的负流和正流（P<0.05）。R2表示模型解释的因变量方差。箭头上的数字表示显著的标准化路径系数。土壤养分包括土壤有机碳含量、NH4+-N含量、NO3--N含量、Olsen-P含量等。
表3 通过对添加Cd处理后的指示类群的分析，确定在门水平上的类群为根际潜势指示类群
结论
本研究对共生微生物如何影响根际微生物类群以协助苜蓿抵御Cd胁迫提供了新的认识，其中根际群落成员间的相互作用或接种后群落组合的动态是重要因素。与单一接种相比，根瘤菌和AMF联合接种对苜蓿抗Cd胁迫的综合效应最大。根瘤菌和AMF共接种对主要细菌类群（变形菌、放线菌、酸杆菌和耐氯菌）产生强烈影响，主要通过帮助植物从根际吸收养分和减少植物光合作用产生的C分配到土壤中来提高苜蓿对Cd胁迫的抗性。这些研究结果对进一步提高植物的抗逆性，保证牧草和作物的生产具有重要意义。
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