科研 | Theranostics：对硅肺病的多组学研究揭示了PGD2和TXA2为潜在的治疗靶点（国人佳作）

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编译：微科盟向阳而生，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

硅肺病是一种严重的职业病。当前对于硅肺病的治疗很大程度上限制了其可行性（例如：肺移植）或者，不能有效的延长患者的存活时间（例如：洗肺）。因此，临床上急需有效的药物延缓该疾病的进程。为了系统的描述与硅肺病相关的病理学变化以及发现潜在的治疗靶点，我们采用了器官移植过程中的人体肺脏组织进行转录组分析法，对人体肺脏组织进行的转录组分析与硅肺病小鼠肺脏的转录组和代谢组进行整合分析。多组学的结果通过qPCR，Western Blot和免疫组化进行验证，而雷马曲班（Ramatroban）对于硅肺病治疗的效果采用二氧化硅诱导的小鼠模型进行评估，结果我们在硅肺病病人和小鼠的肺部发现广泛发生的代谢变化。靶标性代谢物的定量以及其合成酶表达的验证表明花生四烯酸（AA）通路代谢产物，前列腺素D₂（PGD₂）以及凝血噁烷（TXA₂）在硅肺病中都显著的上调表达。我们进一步考察了雷马曲班，一种PGD₂和TXA₂受体的拮抗物，在采用小鼠模型时治疗硅肺病的效果。结果表明与对照组相比，雷马曲班显著减轻了二氧化硅诱导的肺部炎症，纤维化以及心肺功能丧失。我们的结果表明AA代谢物重编程的重要性，特别是PGD₂和TXA₂在硅肺病进程中的效应。通过对这两个前列腺素类化合物的阻滞，雷马曲班可能是一种新的潜在抑制硅肺病发展的药物。

论文ID

原名：Multi-omics study of silicosis reveals the potential therapeutic targets PGD₂ and TXA₂译名：对硅肺病的多组学研究揭示了PGD₂和TXA₂为潜在的治疗靶点
期刊：Theranostics
IF：8.579发表时间：2021.01通讯作者：王婧，陈静瑜通讯作者单位：北京协和医院，南京医科大学附属无锡人民医院

实验设计

实验结果

1.RNA-Seq在硅肺病患者中表现出代谢重编程
为了系统性的研究硅肺病患者分子水平上的变化，我们采用针对10个晚期硅肺病人和7个对照个体肺脏进行RNA-Seq。通过PCA，这些样本被分成了两个簇，暗示在硅肺病患者中巨大的转录组改变（图1A）。差异表达分析揭示了两组之间1329个差异表达基因（调整p < 0.05；绝对倍数变化 > 2；至少1个样本的FPKM ≥ 1）。在硅肺病患者中，556个基因上调，773个基因下调（图1B）。为了阐明在硅肺病形成过程中哪条通路是主要的，我们接着对差异表达基因进行了功能富集分析。与“免疫力”、“代谢”、“信号转导”以及“蛋白质消化和吸收”相关的条目在KEGG通路中被发现显著的富集（p < 0.05）（图1C和图S1A）。与之前研究一致的是，几种炎性细胞，包括淋巴细胞和嗜中性粒细胞在硅肺病患者的肺中被激活（图1C和图S1）。值得注意的是，一些代谢通路，包括AA代谢，在KEGG结果中高度富集，表明代谢性重编程是硅肺病发生的可能步骤（图1C）。图1 对硅肺病病人和健康捐赠者的转录组分析
（A）样本的主成分分析。红色点表明来自硅肺病病人的样本（n = 10），蓝色点代表来自健康捐赠者的样本（n = 7）。（B）热图显示硅肺病患者和健康肺的差异表达基因。每列代表一个样本，每行代表一个基因。基因的表达范围采用Z评分表示。（C）显著富集的差异基因的KEGG条目。四个超类别基于通路的类型被高亮表示。
2.基于时间过程的RNA-Seq显示代谢重编程与小鼠肺部硅肺病的发生有关
由于来自人类样本的数据仅仅反映了重度硅肺病的变化，接着我们构建了二氧化硅诱导的硅肺病小鼠模型去研究覆盖整个硅肺病进程时间跨度的分子变化。考虑到大多数硅肺病病人都为男性，在此研究中仅雄性小鼠被选择。在三周，六周以及九周灌注二氧化硅/PBS后，我们度量了小鼠的体重和肺功能，然后评估了其炎症状态以及肺部纤维化的程度。结果显示，肺功能丧失和肺纤维化在二氧化硅灌注3周（图S2-4）后发生。随着二氧化硅暴露时间延长，硅肺病表现为逐渐加重的纤维化伴随慢性炎症（图S2-4）。为了研究硅肺病发展潜在的机制，我们采用二氧化硅诱导小鼠模型（图2A）开展了基于时间过程的RNA-Seq分析。由于对于所有指标而言，在3个PBS组中无显著差异（3周，6周以及9周）。我们采用了灌注PBS 3周的小鼠作为对照组，通过聚类分析对来自对照组（Ctrl）的样本与在二氧化硅中分别暴露了3，6和9周（S_3, S_6, S_9）的小鼠样本分别进行了分析（图S5A）。我们在4个不同的时间点共发现13787个差异表达的蛋白质编码基因（校正p < 0.05）（对照，S_3, S_6, S_9）（表S2），通过在最大值和最小值之间设定至少2倍表达量改变阈值，以及对于每个基因进行1000次的重排分析，我们在p < 0.05水平下揭示了10个显著的时间过程谱。这10个表达谱之后根据其差异上调或下调表达的时间点被组成5个模式（模式1到模式5）（图2B）。模式1反映了在疾病进程中表达量持续上升或下降的连续响应的基因；模式2包括了早期响应的一些基因，这些基因在3周的二氧化硅灌注后都会表现为上升或下降；模式3包含了早期和中期阶段的响应基因；模式4包含了早期和晚期阶段的响应基因；模式5包含了早期和晚期中逆向表达的基因。进一步的KEGG富集分析表明每种模式的主要条目与不同的通路相关，包括“代谢”、“信号转导”、“蛋白质消化”、“RNA和蛋白质加工”、以及“细胞-细胞互作”（图2C）。更为重要的是，模式1包含了在硅肺病整个进程中发生持续变化的基因，主要富集在代谢相关通路中。之后我们在这些代谢相关的通路中检查了基因表达的趋势并发现大多数在二氧化硅处理后表现为上调，表明在硅肺病的进程中强的代谢活性（图2D）。总结我们的发现可知，假设代谢重编程过程伴随了硅肺病的进程，人类硅肺病中差异表达基因也富集在相应的代谢通路中（图1C）。图2 采用来自硅肺病小鼠模型时间过程的转录组分析
（A）收集肺部组织进行RNA测的不同时间点的草图。采用PBS注射小鼠3周作为对照。肺部组织是来自对照组（Crtl）以及在3,6和9周二氧化硅组被收集用于RNA测序。（B）通过STEM方法鉴别出的显著的基因表达模式。x-轴代表模型构建的不同时间点，以及所有表达模式，遵循对照（Ctrl），二氧化硅灌注3周（S_3），二氧化硅灌注6周（S_6），以及二氧化硅灌注9周（S_9）。（C）KEGG富集导致（B）中的5种不同模式。对于每一种模式，仅前10个（如果有）显著的条目被显示，同时5种不同的颜色分别代表5种不同的模式。（D）所有代谢相关的KEGG通路机制在模式1中富集。外圈的这些点代表每一个条目的基因，其中红色表示硅肺病个体中上调的基因，同时蓝色表示下调基因。中心的彩色柱子显示Z评分，对于每个条目基因活性的粗略度量。较高的Z评分意味着该条目中更多的上调基因。
3.无靶标的代谢物组学表明花生四烯酸在硅肺病小鼠肺部的总体表达的增强
为了鉴别与硅肺病相关的代谢变化，我们基于无靶标的代谢谱采用硅肺病小鼠和PBS对照组小鼠肺部组织进行了广泛的液相随机质谱（LC-MS）分析。OPLS-DA和PCA分析显示出这两组之间广泛的代谢差异（图3A和图S6）。定量以及对代谢物的鉴别导致了212个差异代谢物被鉴定，与对照组相比，其中138个具有较高表达水平，74个具有较低表达水平（表S3）。接着我们将212个差异的代谢产物组织进入几个超级类别中，并发现“有机酸及其衍生物”以及“液体及液体样分子”可解释多于一半的代谢产物（图3B），显著的富集在“花生四烯酸代谢”以及“嘌呤代谢”（图3C）。另外，AA通路代谢物的表达显示出了总体的增加（图3D），表明在硅肺病进程中AA代谢的关键作用。图3 采用硅肺病小鼠肺脏进行的基于LC-MS非靶标性的代谢组学
（A）样本的OPLS-DA。绿色代表PBS组（n = 10）。通过RP和HILIC选择的复合物被进行分别分析。（B）在PBS和硅肺病组之间鉴别出的212个显著变化的代谢产物。每一种颜色展示一类代谢产物，这些代谢产物具有特定的数量和比例在饼图中高亮显示。（C）KEGG通路富集了212个差异的代谢产物。两条显著富集的通路p < 0.05通过其名字被高亮标记。（D）在两个显著富集通路中代谢产物的表达趋势。x轴为在硅肺病组与PBS组相比log₂转换的相对代谢产物倍数改变。

4.靶标性代谢物表明PGD₂，PGE₂以及TXA₂在硅肺病小鼠肺部的表达

为了证实AA通路产物的富集，我们对一组数量为106个的AA来源的代谢物（图S4）采用靶标代谢物方法进行定量。在采用低浓度对代谢物进行筛选后，上述47种代谢物被保留进行进一步的统计分析（图S5）。最终，16种代谢物在硅肺病小鼠与对照组比较时被发现发生了显著的变化（倍数变化 > 2；t检验p < 0.05）。在16种显著变化的代谢产物中，11种属于前列腺素类及其衍生物，该衍生物为所有检测的代谢物中数量较多的组（p = 0.05，卡方检验）（表S6）。因此我们将我们的分析集中在前列腺素类似物中，这些代谢物通过环氧合酶（COX）从AA产生（图4B）。在5种前列腺素类衍生物中（PGE₂，PGF_2α，PGI₂，PGD₂，TXA₂），PGD₂，PGE₂和TXA₂在硅肺病小鼠的肺脏中显著增加（图4A和4B）。图4 采用硅肺病小鼠肺脏对于花生四烯酸代谢通路靶标代谢产物的分析
（A）在PBS和硅肺病组中前列腺素类化合物及其衍生物代谢产物的绝对浓度。不同组间采用两尾非配对t检验进行比较。* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001为硅肺病组（n =10）与PBS组（n = 8）相比的差异。（B）花生四烯酸代谢通路以及在硅肺病个体中代谢物的变化的模式图。 

5.PGD₂和TXA₂合成在患硅肺病小鼠的肺脏中显著上调

为了证实靶标代谢组学分析的结果，我们检查了小鼠肺部编码TXA₂（Tbxas1/TXS），PGD₂（Ptgd/PGDS2以及Hpgds/H-PGDS）以及PGE₂（Ptges3/cPGES）的关键性的基因。正如图5A所示，这些编码合成TXA₂和PGD₂，但并非PGE₂的基因mRNA水平，在患硅肺病的少数肺部显著上调。相似的，3个相应基因的蛋白质水平（TXS，PGDS2以及H-PGDS）在患硅肺病小鼠的肺部通过Western Blot（图5B）和免疫组化（IHC）染色（图5C和图S7）检测也表现出显著的上调。图5 PGD₂和TXA₂的合成在患硅肺病小鼠和病人中表达的证实
（A）在肺脏组织中灌注二氧化硅或PBS的相关基因的mRNA表达水平（Tbxa1，Ptgds，Hpgds，以及Ptges）（B）在灌注二氧化硅或PBS小鼠肺脏组织中代表性的Western Blot图像以及蛋白质定量（TXS，PGD2，H-PGDS以及cPGEs）。（C）代表性的免疫化学染色以及TXS，PGDS2，H-PGDS，以及cPGES在灌注二氧化硅以及PBS小鼠肺脏组织中的免疫活性定量。红棕色表明阳性染色。所有比例尺为50μm。（D）硅肺病患者或健康捐献者基因的相对mRNA表达水平（TBXAS1，PTGDS，HPGDS以及PTGES3）。（E）TXS，PGDS2，H-PGDS以及cPGES在硅肺病患者以及健康捐献者肺脏组织中的Western Blotting。（F）TXS，PGDS2，H-PGDS以及cPGES在硅肺病患者以及健康捐献者肺脏组织中的免疫组化染色。红棕色表明阳性染色。所有比例尺为50μm。所有上述实验至少进行3次。定量分析结果用平均值± SEM的形式表示，差异采用两尾非配对t检验进行。A，B，C组中* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001代表硅肺病组（n = 6每组）相对PBS组（n = 6 每组），D，E，F代表硅肺病组（n = 5每组）相对于捐献者组（n = 5每组）。
我们进一步检测了人类肺部这些合成物的表达水平。与在小鼠中一致并支持RNA-Seq结果，PGD₂和TXA₂合成的mRNA和蛋白质表达在与对照组相比的硅肺病人肺部显著提高（图5D-F和图S8，S9）。总之，这些数据表明PGD₂和TXA₂可能参与了硅肺病的病理发生。
6.雷马曲班，作为PGD₂和TXA₂受体的拮抗剂，抑制硅肺病的发展进程
TXA₂和PGD₂水平的增加能够增强与其对应受体，即血栓素前列腺（TP）受体和PGD₂受体包括D-前列腺素受体1（DP1），DP受体2（DP2）以及TP受体。雷马曲班，作为一种DP2和TP受体的选择性阻滞剂，抑制了通过PGD₂-DP₂和TXA₂/PGD₂-TP受体轴介导的促炎性，溶纤维原以及血管收缩作用。因此，我们假设雷马曲班可能能够减轻硅肺病的进程。在实际的临床过程中，硅肺病人由于难以被正确诊断通常会发展为肺纤维化。我们最初的结果表明在小鼠中进行雷马曲班的治疗在灌注二氧化硅三周后的效果与人类硅肺病的临床症状最为相似（图S2-4）。所有小鼠在3周治疗后被处死时都保持存活状态（图6A），并且在用雷马曲班治疗的小鼠中没有观察到器官毒性（图S10）。正如图6B和图S11所示，雷马曲班显著的减轻了肺功能的损伤，并减轻了异常的右侧心室收缩压（RVSP），右侧心室肥大指数（RVHI），以及由于硅肺病导致的肺动脉重塑。硅肺病诱导的炎性细胞在支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺脏中的增加由于雷马曲班的作用而减轻（图6C和6D）。另外，与对照小鼠相比（图S12），在雷马曲班治疗的小鼠包括TNF-α，IL-6，IL-1β以及IL-18的促炎性细胞因子在BALF的上清液中显著下降。由于IL-1β和IL-18是由NLRP3炎性小体通过激活半胱天冬酶1而产生，我们进一步评估了NLRP3，半胱天冬酶-1以及IL-1β在肺脏中的表达。我们的数据显示NLRP3，半胱天冬酶-1以及IL-1β在mRNA和蛋白质水平的表达在响应硅肺病刺激中显著增加并且由于雷马曲班的治疗而显著减轻（图S13）。另外，雷马曲班通过降低胶原纤维含量，降低羟脯氨酸水平和降低纤维连接蛋白和胶原蛋白I两种mRNA和蛋白质的表达水平（图7B，图7D-E以及图S14）显著减轻了肺部纤维化（图7A）总之，这些结果表明雷马曲班可作为一种治疗制剂通过抗炎性和抗纤维化预防硅肺病的发展，以及具有心肺保护效应，同时无明显毒性。

讨论

在当前的研究中，我们整合了多组学方法揭示了硅肺病肺部的分子变化。硅肺病病人和小鼠肺部的RNA-Seq分析表明代谢重编程与硅肺病的病程有关。结合非靶标和靶标性的代谢组学分析的方法，我们发现AA代谢通路参与了硅肺病的进程。进一步证实AA代谢物合成的mRNA和蛋白水平表明两种前列腺素类物质，PGD₂和TXA₂在硅肺病病人肺部的持续上调，表明PGD₂和TXA₂可能参与了硅肺病的进程。我们后续证实了雷马曲班，一种PGD₂和TXA₂受体的拮抗剂，能够成功在小鼠模型中减轻硅肺病进程，表明其在治疗硅肺病中的潜在临床应用。PGD₂和TXA₂在炎症和纤维化过程中发挥重要作用。TXA₂可促进过敏性炎症和肺部纤维化，而PGD₂在炎症和纤维化过程中的主要作用仍然有争议。在一些研究中，PGD₂水平的上升被在认为疾病进程中具有促炎性和促纤维化的作用，相反，其它研究报道了其在急性肺部损伤中的抗炎性作用和肺部纤维化过程中的抗纤维化作用。在二氧化硅诱导的肺部纤维化过程中，AMs被证实在暴露于二氧化硅的过程中可产生和释放PGD₂和TXA₂。但是，其在人类和动物硅肺病模型中体内作用仍然未知。我们的研究发现，采用整合多组学方法加之实验验证，PGD₂和TXA₂在硅肺病发生过程中显著上升。后续利用雷马曲班进行的药物实验，通过对PGD₂和TXA₂受体的拮抗，进一步证实了PGD₂和TXA₂对于促进肺部炎症和纤维化过程中是至关重要的。雷马曲班对于治疗过敏性鼻炎方面具有临床效果。之前的研究集中于其在哮喘和过敏性疾病中的效应。我们的结果证实了雷马曲班也具有抗纤维化和心肺保护效应，这拓展了其临床意义。在我们的研究之前，一些研究使用动物模型探索了治疗硅肺病所需的一些临床药物。Guo等报道了哌仑西平能够降低二氧化硅诱导的大鼠肺泡炎症和纤维化。其它报道表明黄苓苷、多奥辛以及二氢丹参酮I能够减轻小鼠中二氧化硅诱导的炎症和/或纤维化。我们的研究结果表明雷马曲班可显著的减轻硅肺病小鼠肺部炎症和纤维化。与这些之前的研究（在二氧化硅灌注后一天后给药）相反，我们是将小鼠模型暴露于二氧化硅中三周后，待其发展到纤维化阶段后采用雷马曲班治疗。假设对于硅肺病患者的治疗通常是在临床难以诊断的肺纤维化阶段，我们的研究表明雷马曲班可能是一种对于硅肺病患者而言抗纤维化的制剂。另外，我们的研究表明雷马曲班使肺部血管重塑过程减弱并对于患硅肺病的小鼠的心血管具有保护作用。值得注意的是，肺动脉高血压（PH）是硅肺病患者死亡的主要原因。因此我们建议进一步探索雷马曲班作为治疗患PH并发症患者的候选药物。PGD₂和TXA₂怎样上升并参与硅肺病的发展过程的机制仍然缺乏探索。之前的报告表明miRNA可能参与了下游PGD₂和TXA₂的信号转导过程，而miR520的表达与COX以及PGD₂在患血管狭窄病人合成通路中的PTGDS具有负相关性。miR20a的过表达降低了TXA₂在人脐静脉内皮细胞中的表达水平。另外，miR-592-5p可能抑制了PGD₂/DP的信号通路以保护海马神经元的损伤。在硅肺病中，越来越多的研究证明了miRNA在抗纤维化或促纤维化过程中的作用，或表明miRNA作为肺部纤维化诊断的生物学标记的潜在用途。所有以上的报道表明一些miRNA可能在PGD₂和TXA₂上游的产生过程中发挥作用，或者在PGD₂和TXA₂信号转导过程中发挥作用，因此作用于硅肺病的病程。后续研究应对miRNA以及PGD₂和TXA₂在硅肺病信号转导过程中的通路中的相互作用进行研究。之前的研究发现暴露于二氧化硅中可导致氧化应激以及ROS的过度聚集，以及ROS-NLRP3通过AMs进行信号转导的激活。其下游因子包括半胱天冬酶-1，IL-1β和IL-18表现出上升，与二氧化硅诱导的肺部炎症和纤维化有关。一项最近的研究表明TXA₂激活了TP受体，通过增强的NADPH和ROS的产生增加了氧化应激。相似的，Rossi等表明PGD₂促进了ROS的生成。这些发现表明PGD₂和TXA₂可能通过ROS-NLRP3信号通路促进硅肺病的进程。与这些发现一致，我们观察到二氧化硅诱导的NLRP3，半胱氨酸酶1，IL-1β和IL-18表达的上升。另外，其表达水平可通过使用PGD₂和TXA₂拮抗剂雷马曲班降低（图S13）。因此，我们假设雷马曲班可能激发了其通过下调的ROS-NLRP3信号通路引发的抗炎性和抗纤维化作用，另外，雷马曲班在减轻硅肺病进程中具有其它潜在机制。目前，上升的PGD₂和TXA₂水平被证明可促进促炎性因子（例如IL-4，IL-5和白细胞因子B4（LTB4））和通过激活DP2和TP受体而介导的促纤维化细胞因子（例如IL-10，IL-13和TGFβ等）的产生。同时，对DP2或TP受体的阻滞能够减轻纤维化疾病中肺部炎症和纤维化。基于这些发现，我们提出另一种雷马曲班保护的作用机制为通过下调一些诸如IL-4和IL-5细胞因子的表达而发挥作用，而进一步的研究需要评估这些细胞因子的表达。我们承认本研究的一些局限性。首先，雷马曲班减轻硅肺病发生的潜在机制仍然需要被进一步研究。其次，由于雷马曲班在硅肺病小鼠中的治疗剂量是由通常使用的过敏性鼻炎的临床剂量所转换而得到，雷马曲班在硅肺病治疗中的最佳剂量需要进一步研究。第三，仅仅有限量的人类肺部组织在此研究中被使用，意味着不能用这些样品进行代谢组学研究。使用人体样本进行的代谢组学研究印证了我们在小鼠模型中获得的研究数据，总之，我们的研究表明PGD₂和TXA₂通过非靶标和靶标的转录组分析的整合转录组学参与了硅肺病的进程。作为PGD₂和TXA₂的双拮抗剂，雷马曲班在二氧化硅诱导的小鼠模型中减轻了硅肺病症状，并为这种疾病的治疗提供了潜在的治疗靶点和更加深入的见解。图6 雷马曲班治疗提高了患硅肺病小鼠的肺部功能和炎症
（A）雷马曲班在硅肺病小鼠中治疗的模式图。（B）肺部功能度量参数，包括Rrs，Crs以及Cst。（C）BALF中的炎性细胞数（巨噬细胞，淋巴细胞以及嗜中性细胞）。（D）HE染色以及肺部炎症定量化描述的代表性图。上比例尺代表1000μm，下比例尺代表50μm。所有上述实验至少进行3次。所有数值用平均值 ± SEM所显示。差异采用双因子ANOVA分析，并采用Bonferroni校正。NS：不显著；* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001。
图7 雷马曲班减轻了硅肺病小鼠肺部纤维化
（A）Masson染色和肺部纤维化定量的代表性图。上图比例尺为1000μm，下图比例尺为50μm。（B）FnI和CollaI mRNA的相对表达水平。（C）小鼠肺部评估获得的羟基脯氨酸水平。（D）对FN和COL1定量的Western blot代表性图。（E）免疫组化和COL1在肺部切片中的免疫活性定量的代表性图。红棕色表明阳性染色结果。上比例尺代表1000μm，下比例尺代表50μm。所有上述实验至少进行3次。所有数值用平均值 ± SEM所显示。差异采用双因子ANOVA分析，并采用Bonferroni校正。NS：不显著；* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33500731/   

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