科研 | Microbiome:英国盐沼微生物群落调节木质纤维素解构的机制策略

点击蓝字↑↑↑“微科享”，轻松关注不迷路

编译：微科盟sunshine，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读盐沼是天然封存有机碳的主要储存库，具有很高的有机质埋藏率，由高生产力的天然植物产生。积累的碳主要以木质纤维素的形式存在，木质纤维素由功能各异的微生物群落代谢，然而，协调这一过程的生物体以及调节这种碳储备的积累、组成和持久性的机制尚不清楚。本研究应用元蛋白质组学和16S rRNA基因图谱研究了英国天然盐沼表层沉积物中木质纤维素的原位分解。结果表明：盐沼中木质纤维素的降解主要由Gammaproteobacteria, Bacteroidetes和Deltaproteobacteria组成。作者鉴定了42个木质纤维素分解菌科，这些家族分泌木质纤维素活性水解家族酶GH3、GH5、GH6、GH9、GH10、GH11、GH13和GH43。当真菌存在时，作者没有检测到真菌对木质纤维素分解的贡献。对陆地环境中木质纤维素的降解起重要作用的酶有漆酶、过氧化物酶和裂解多糖单加氧酶等，其含量并不丰富，而与木质纤维素中的木质素和多糖解偶联相关酯酶的含量则相当丰富。本研究确定了一组以前没有定义的细菌，它们促进了盐沼环境表层沉积物中木质纤维素的降解，并描述了它们用来促进这一过程的酶机制。本研究结果加深了对盐沼表层沉积物中木质纤维素固碳的微生物和分子机制的理解，并为盐沼沉积物中多酚类物质的富集提供了潜在的酶机制。

论文ID

原名：Mechanistic strategies of microbial communities regulating lignocellulose deconstruction in a UK salt marsh译名：英国盐沼微生物群落调节木质纤维素解构的机制策略
期刊：Microbiome
IF：11.609发表时间：2021.02通讯作者：Daniel R. Leadbeater & Simon J. McQueen-Mason & Neil C. Bruce
通讯作者单位：约克大学

实验设计

实验结果

1.元蛋白质组的功能归属

为了鉴定参与生物质分解的木质纤维素分解酶，作者对细胞外蛋白质进行了元蛋白质组学分析，通过使用膜不可渗透生物素化标签的亲和标记过程完成。因为木质纤维素是一种不溶性大分子，一般要被胞外酶分解。涉及的许多酶粘附在木质纤维素或微生物上，使用表面活性剂提取它们会导致细胞裂解和细胞内蛋白质的污染。此标记方法避免了细胞内污染物的问题，允许关注细胞外和细胞表面蛋白。

对转录组的注释显示，在44,334个ORF，CAZyme（碳水化合物活性酶）在所有转录数据库中的总比例为429.27±62.16Tpm。蛋白质组学分析鉴定了11,268个蛋白质，其中320个被注释为CAZyme家族ORF中的结构域。在元蛋白质组学中缺失的转录数据库主要是与木质纤维素降解无关的家族、与核心细胞内活性相关的家族(AA6、CE14、GH32、GH57、GH73、GH92和GH108)或CAZyme家族(GH1、GH2、CE7)。相反，元蛋白质组主要由CAZyme家族CE3、CE4、Ce6、PL1、PL4、GH35和GH43组成。CAZyme同源物仅占总元蛋白质组的0.72-0.99%，与以前的体外报道一致。元蛋白质组CAZyme图谱显示了三个占主导地位的簇，它们包含了不同的活性集合，具有时间上的丰富性(图1c)。其中糖苷水解酶(GH)种类最丰富。GH3、GH5和GH6家族有丰富的酶，这些通常与纤维素降解有关，其中许多与碳水化合物结合结构域(CBMs)有关。CBM剖面突出了两个丰富的欧几里德簇(图1d)，其中主要的簇包含与纤维素和基质多糖结合有关的CBM2和CBM44，次要簇包含分别与纤维素、半纤维素和甲壳素结合的CBM10、CBM5和CBM60。与半纤维素降解相关的家族很多，尤其是与木聚糖降解相关的GH10、GH11和GH16。

CAZyme家族蛋白的分布与生物量组成相结合，揭示了木质纤维素生物聚合物(图1a，b)的连续靶向性，这与元蛋白质组中CAZyme蛋白的丰度在时间上是同步的。纤维素的最大损失发生在第一周，可能是由高丰富的GH6和GH5家族与CBM2和CBM44结构域协调进行的，这些酶针对因机械分离而产生暴露的纤维素，而木质素的降解表现出速度限制(第一周和第二周)。在3-5周内，基质多糖的损失速率增加，这与GH11、GH10、GH13和GH43家族酶的丰度增加相对应，同时纤维素的水解速率也随之降低，这表明基质多糖限制了纤维素的获得。在第6~16周，纤维素的解构速率增加，并建立了降解平衡。一个有趣的发现是，碳水化合物酯酶(CE)比许多生长激素家族酶(图1b)更丰富，特别是家族1(CE1)的酶，主要表现为阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶。作者只鉴定了两个AA家族：AA7(葡萄糖低聚糖氧化酶和甲壳低聚糖氧化酶)，它们在第三周短暂存在；AA2(含有II类木质素修饰过氧化物酶)，在整个研究过程中都是低丰度的。

图1 元外蛋白体内木质纤维素组成和碳水化合物活性酶分布的时间变化。a.剩余生物量的木质纤维素组成。b.木质纤维素内部的组成变化速率，虚线表示0变化；L为木质素；H为半纤维素；C为纤维素。c.欧几里德聚类的酶类图谱显示了最丰富的30个类别：GH，糖苷水解酶；CE，糖酯酶；AA，辅助活性；PL，多糖裂解酶。d.碳水化合物结合结构域的欧几里德聚类。

2.元蛋白质组的分类关系

真菌和古菌在代谢蛋白质组注释中的代表性很低，分别只占总蛋白质组的0.28-1.46mol%和0.04-0.2mol%，细菌产生99-100mol%的CAZymes。事实上，在CAZyme图谱中，非细菌/古生菌来源的蛋白质显示出与AA2和AA3酶的同源性。这与总元蛋白质组相一致，其中66.5-79.5mol%来源于细菌/古菌。在16S rRNA基因衍生的群落分布中，来自家族的蛋白质占75±6.9% mol%。结果表明，变形杆菌和拟杆菌是木质纤维素酶的主要产生菌(图2a)。Gammaproteobacteria和Deltaproteobacteria分别占总CAZyme的39.03±13.65%和7.48±3.95%，Bacteroidia, Flavobacteriia and Cytophagia分别占总CAZyme的12.45±6.30%、9.25±2.55%和7.45±3.03%。这与这两个门的16S rRNA基因丰度保持在78.43±4.10%是一致的。相对于它们的丰度而言，CAZyme生产力很高的类群是Bacteroides、Paludibacter、Flexithrix、Sphingobaciaceae、Melioribacter、Chromataceae、Peptodiccaceae和Salinivirgaceae。CAZyme多产但分辨率较差的属包括Teredinibacter、Sportopopaga、Aquimarina、Hyunsoonleella、Planorics、Pseudphingobacus、Desulfosporosinus、Formosa、Simiduia、Sorangium、Lentimicrobium、Arcticbacter、Desulfobulbus、Saccharophagus和Chitinophaga。

真菌OTU丰富度变化显著，从第1周到第2周的观察峰值分别为253±35和360±18.54，差异显著，之后逐渐但持续下降至第16周。920个OTU中有558个被鉴定为类群。真菌种类以子囊菌为主(56.38±4.07%)，担子菌门(5.22±1.57%)贡献较小，在第0天的沉积物中，作者观察到极少量的担子菌门、合子菌门。在整个16周的时间过程中，木质纤维素相关真菌群落中的酵母菌和毛孢子菌数量一直很丰富(分别为25.6±3.23%和10.85±1.74%)。早期真菌的显著成分包括Hypocreales，Capnodiales和Tremellales(1-3周)，然后迅速下降。作者根据营养获取策略对这些OTU进行功能分类，发现优势菌群为腐生菌，其次是病原菌，腐生菌从0天沉积物外群的32.3%逐渐富集到第16周的86.1±3.32%。内生菌-地衣寄生虫-植物病原菌-不明腐殖体在第2周和第16周一致(20.1±1.91%)，动物病原体-内生菌-地衣寄生虫-植物病原菌-土壤腐殖体-木材腐殖体在1~3周才有较大的一致性(13.8±1.72%)，而动物病原体-内生菌-地衣寄生虫-植物病原体-土壤腐殖体-木材腐殖体在1~3周才有较大的一致性(13.8±1.72%)。有趣的是，作者发现与木质纤维素底物如木材腐生菌和叶片腐生菌更新相关的模式在第0天沉积物外群中比木质纤维素相关群落中更丰富。

生产型谱系显示，相对于第0天沉积物外群，CAZyme家族具有迅速的富集性。这表明，在沉积物中，最高有13.9%的细菌/古生菌在科水平上是木质纤维素的降解者，而OTU的丰富度最高。在生物量内的第一周，CAZyme生产力谱系丰富了3.77±0.11倍，占总群落的52.40±1.51%，而OTU丰富度下降(1020±65)，在第二周增加到59.56±1.66%(图2b，c)。作者观察到OTU丰富度随时间的变化显著，从1周到3周以及之后的所有时间点都显著增加，而CAZyme产生成员的丰度在这段时间内没有明显下降，这表明不同的异养菌和次生代谢物的定殖，总CAZyme mol%在整个时间序列中没有显著差异。作者注意到变形杆菌和类杆菌中最高产的类群之间有一定程度的一致性。

尽管Gammaproteobacteria的总体丰度有所下降，但它在整个过程中CAZyme产量较高。Vibrionaceae在第1周出现短暂的丰度高峰(22.98±3.27%)，之后逐渐下降(第2周为5.25±1.04%，第3周为2.70%±0.70%)，表明该分支是快速定殖者和寡养生物。Vibrionaceae主要由Vibrio和 Photobacterium两个属组成。随后，Vibrio似乎被Alteromonadaceae，Saccharospirillaceae(Reinekea)和Cellvibrionacea所击败，它们在1-5周内占了Gammaproteobacteria图谱很大一部分。Gammaproteobacteria的丰度被Deltaproteobacteria所取代。尽管CAZyme的表观丰度较低，但Firmicuts和Verrucommicrobia可分泌CAZyme，特别是Peptococcaceae、Planococcaceae、Paenibacillaceae和Rubritaleaceae。

图2 CAZyme的分类群及其各自的CAZyme贡献。a.产生CAZyme的谱系与各自的CAZyme生产力的分布，虚线以下的分类群在群落剖面中没有被识别。b.细菌图谱由16S rRNA基因序列同源性阐明，每个时间点为五个生物重复数的平均值。c.CAZyme产生菌图谱，对非CAZyme产生菌进行了筛选，方框显示OTU丰度，未对这些数据进行进一步过滤。

图3 元外源蛋白质组、CAZyme类和分类谱系之间的网络关联。显示的数据是四个时间点的平均值。分类群和CAZyme纲的节面积分别与生产力和丰富度成正比。边缘颜色和宽度与输出大小相关。糖苷水解酶(GH)家族；蓝色节点，糖酯酶(CE)家族；红色节点，辅助活性(AA)家族；橙色节点，多糖裂解酶(PL)家族；黄色节点，糖结合结构域(CBM)家族；紫色节点。NA，未分配。

讨论

本文研究了天然盐沼环境中表面水平木质纤维素分解的过程，展示了可以在原位监测木质纤维素分解的框架。研究数据表明，总的天然微生物组中有很大一部分是木质纤维素反应性的，能够快速定植和重组。本研究的蛋白质组学研究揭示了木质素和多糖以及聚糖水解酶之间靶向连接的活性富集，以及攻击木质素的氧化酶明显稀疏。尽管作者收集的总生物量在16周内减少了约70%，但研究结果符合先前实验中提到的一阶衰减模型。以前的研究表明，大多数颗粒分解发生在进入系统的第一年内，并经历了三个阶段：可溶性化合物的淋溶、分解和以分解速度减慢为特征的最终难熔阶段。在本研究中，8周和16周的不应期分解速率分别为0.22±0.087/天和0.176±0.03%/天，说明本实验进入了不应期。作者评估了表层木质纤维素的好氧分解，证明它比地下腐烂要有效得多。Valiela等人从冬季开始，对互花米草的相对组成进行了24个月的探索性研究。虽然由于生物量的位置、开始日期和种类不同（显著影响分解），研究结果与本研究结果不具有直接可比性。但不可否认，这两项研究的木质纤维素降解曲线之间存在着同步性。这两项研究都表明，纤维素和半纤维素最初是增加的，接下来是木质素的降解，然后是半纤维素的降解。当木质素增加时，半纤维素的降解与纤维素的降解一致。木质素的相对富集表明这种生物聚合物并不是微生物群落针对新陈代谢的目标。众所周知，盐沼沉积物中木质素衍生的高分子量多酚含量非常丰富，随着深度的增加，这些多酚的浓度会增加。当木质素穿透木质纤维素基质中的核心多糖时，必须先将其去除，然后内部多糖才能被消化。氧化酶是陆地系统中修饰和降解木质素的主要机制，然而在本研究中，只有AA2家族成员以低丰度存在。这些酶攻击木质素部分来改变结构。这些发现表明，原生盐沼生物具有负责木质素修饰的酶，这些酶目前尚不为人所知，或者它们采用了其他机制，能够促进木质纤维素中存在的有价值的糖类的获取。相反，作者注意到盐沼偏外蛋白质组具有高表达的碳水化合物酯酶(CE)，特别是来自家族CE1。CE1家族酶的功能是非氧化性地去除木聚糖中的肉桂酰酯和乙酰酯，分别破坏半纤维素和木质素以及半纤维素和纤维素之间的木素-碳水化合物复合界面。木质素碳水化合物复合键被认为主要由芳酯和芳基醚键组成，芳醚键的水解使木质素解偶联，暴露出剩余多糖的表面。CE1家族包括一系列酯酶，特别是那些水解阿拉伯木聚糖与阿魏酸和香豆酸残基之间的酯键的酯酶。阿拉伯木聚糖中的阿魏酸残基在提供阿拉伯木聚糖链之间以及阿拉伯木聚糖和木质素之间的连接方面特别重要。CE1还含有木聚糖乙酰酯酶，可以去除阿拉伯木聚糖中的乙酰基，对其三维构象和结合纤维素的能力有重要影响。木质素与木质纤维素多糖的连接可能是GHS获得其底物的主要目标。作者认为，与陆地系统相比，这种机制在盐沼中是有利的，因为液体介质有助于将解离的木素大分子解吸到周围水域，从而绕过了完全解构的要求。这一机制可以解释盐沼沉积物中已知的富含木质素的持久性颗粒通过高分子量酚类物质的裂解而富集的原因。然后，这些酚类可能会受到低丰度AA2家族酶的氧化修饰，导致它们慢慢成为生物可利用的物质。以前的研究表明，沉积物中的木质纤维素降解是由细菌驱动的，这得到了本研究数据的支持，但已知真菌存在于盐沼沉积物中，它们的功能、群落生态和相互作用仍然难以捉摸。作者鉴定了几个与木质纤维素有潜在历史联系的真菌科，主要是Pleosporaceae,Hypocreaceae,Nectriaceae,Sordariacea和Saccharomycetales。已鉴定真菌的营养获取策略表明，优势营养模式是腐殖体(从死亡有机质中获取养分)，其次是致病菌(通过攻击细胞获取养分)及其组合。这表明大多数真菌正在从替代死亡的有机物中获取营养，或者正在利用一种病态营养获取策略，其中木质纤维素不是主要目标。值得注意的是，木腐菌和叶腐生菌在沉积物中存在，但在木质纤维素材料上并不丰富。由于真菌在这个系统中的丰度比细菌少一个数量级，但作者没有在元外蛋白质组中检测到来自这些组的木质纤维素分解酶，本研究数据表明，它们对盐沼沉积物中物质的木质纤维素分解的影响可以忽略不计，它们可能针对存在于木质纤维素聚集体中或共生在木质纤维素聚集体中的替代有机质来源。基于同位素探针实验与盐沼木质纤维素降解有关的细菌家族包括Desulfobacteraceae，Spirochaetaceae，Kangiellaceae，选择性富集的细菌包括Fla-vobacteriaceae，Cyclobacteriaceae，Pseudomonadaceae和Halomonadaceae。由于大多数木质纤维素的解构发生在细胞外基质内，为了成为活性木质纤维素降解剂，因此分解产物对附近的所有微生物都是可用的。作者确定了CortesTolalpa等人报告的所有主要群体。在作者证实这些基团是木质纤维素酶活性分泌物的原位研究中，他还鉴定了另外38个以前未知的能主动分泌木质纤维素活性酶的家族。本文报道的42个CAZyme产生族支持长期的碳封存，其机制似乎通过选择性地避免木质素降解而有利于复杂多糖的降解。这一过程不仅扩大了储存碳库，而且将复杂的碳水化合物还原为细胞外空间内的生物可利用分子，用于更广泛的微生物群落。这里描述的产CAZyme的Gammaproteobacteria似乎是木质纤维素的早期定殖菌，经过分类学重组，有利于异养谱系。Gammaproteobacteria被Bacteroidetes和Deltaproteobacteria分支中的CAZyme产生群所取代。这些结果表明，Gammaproteobacteria家族是生态优势的表层木质纤维素降解菌。在Bacteroidete和Deltaproteobacteria中发现的不同家族表明，它们在表层水平上高度活跃，但可能主导着生物质聚集体的耗氧核心和浅到深的地下沉积物中的碳循环，因为它们在更深的沉积物中被发现非常丰富，然而，它们的生态功能以前是未知的。研究较多的海洋木质纤维分解者Gammaproteobacteria包括Saccharophagus Degradans和与之关系密切的Teredinibacter Turnerae，它们分别属于Alteromonadaceae和Cellvibrionaceae。这两个家族在木质纤维素反应微生物组中都很丰富，并被鉴定为高产CAZymes菌。有趣的是，这两个科在第0天的沉积物外群中都没有表现出它们在盐沼中腐殖体的作用。降解链球菌是一种具有良好特性的自由生活的异养菌，它似乎完全有能力解构复杂的植物细胞壁多糖和许多其他生物聚合物。由于CAZymes的补充和完整的纤维素分解系统，已经探索了使用这些细菌作为木质纤维素糖化酶的来源。降解链球菌培养上清液中的主要CAZyme包括GH3、GH5、GH6、GH9、GH10和GH16，所有这些都与本研究中元蛋白质组学中发现的高度丰富的Gammaproteobacteria相关的CAZyme家族相对应。T.turnerae是一种发现于钻木双壳类中的兼性胞内共生菌，它能分解纤维素，具有降解纤维素的能力，最近发现它含有一系列复杂的木聚糖降解酶和裂解多糖单加氧酶，与降解链球菌相比，它拥有相对较少的CAZymes库。在已充分表征的海洋分离株中观察到含有CMB的多结构域蛋白普遍存在，尤其是在纤维素酶中，本研究中也观察到丰度较高，表明其发挥重要作用。不到40%的陆源纤维素酶含有CBM，传统上认为这种CBM可以增加底物表面的有效酶浓度，从而提高酶的活性。在盐沼中，吸附含有酶的煤层气将起到将酶锚定和定位到底物上的作用，通过防止底物在这些潮间带被冲走，提高底物对分泌物的作用。可能是CAZymes具有CBMS的优势促进了Gammaproteobacteria在盐沼表面水平分解的早期阶段蓬勃发展，这在本研究中的元蛋白质组和独立的16SrRNA扩增子谱中都观察到了。碳水化合物活性酶是一类非常广泛的酶，包括细胞内和细胞外的生物合成以及复杂和简单多糖的分解。从转录本中准确确定蛋白质的胞外定位是具有挑战性的，特别是在盐沼等开发不足的环境中。因此，作者应用外代谢蛋白质组学来确定存在于细胞外基质中的蛋白质，成功地鉴定了81个CAZyme家族，这些家族位于转录组文库中103个元蛋白质组中，这表明细胞外包含的家族有足够的覆盖深度。然而，由于盐沼生态系统是潮间带，作者的分析可能没有检测到瞬时定位的酶。这可能解释了转录组中存在的主要针对果胶的CAZyme家族中的一小部分，但在元蛋白质组中没有检测到，因为果胶被广泛认为是植物次生细胞壁中最可溶性的成分。本研究方法针对的是木质纤维素的表面水平快速解构阶段。虽然盐沼微生物组在沉积物表面随海拔略有不同，但其随深度显著变化。考虑到木质衍生多酚的相对富集，这表明木质纤维素活性群落可以随着深度分层。这些群落可能采用不同于这里确定的替代机制，靶向最顽固、富含木质素的材料，研究结果只捕获了初始的快速表面水平分解阶段。这些发现不能外推到整个盐沼沉积柱，其中大多数碳储量持续存在。需要进一步深入探索微生物群落，以阐明功能分类群及其用于降解富含木质素的碳水化合物复合物的机制，这些复合物逐渐积累并形成广泛的隔离碳池，因为已知底物组成可调节所采用的机制。

结论

本研究捕捉到了木质纤维素分解生物在盐沼表层沉积物上原位发挥作用的过程。作者鉴定了42个能主动分泌酶来解构木质纤维素聚合物的家族，其中38个家族没有先前证实的生态功能。数据表明，细菌主要在沉积物中协调这一过程，尽管存在真菌，但没有检测到真菌的贡献。对元蛋白质组学分析强调，Gammaproteobacteria是早期的木质纤维素分解定殖者，被Bacteroidetes和Deltaproteobacteria暂时取代，这些分类群同时产生了作用于木质纤维素的一系列核心酶。这也揭示了一种潜在的解构机制，这种解构机制是由碳水化合物酯酶家族1酶驱动的，这种酶能够将木质素大分子从木质纤维素复合体中的核心多糖中解离出来。这种降解策略潜在地解释了盐沼沉积物中木质素衍生的多酚类物质的积累。由于本研究评估了早期表层水平的退化，需要进一步的研究来阐明驱动深层沉积物中有机碳储存和周转的机制。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33597033/

----------微科盟更多推荐---------- 

免费生信作图平台——生科云
	长按左侧二维码  进入生科云
生科云所有分析工具可以免费使用，不收取任何直接或间接费用；您还可以在微信上联系微生态老师，随时获取免费的指导，帮助您解决分析时遇到的问题；专业的生信分析团队，持续添加、更新、优化生信云上的分析工具，集成多种生信分析流程，一键批量生成主流科研图，帮您节省时间，有更多的时间探究生物学意义。

----------微科盟精彩文章---------- 

如果需要原文pdf，请扫描以下二维码，加助理获取

微科享期待与您交流更多蛋白组学问题

（联系蛋白组学老师即可申请入群）

请关注下列二维码

了解更多蛋白组学知识