科研 | Adv Sci：姜黄素靶向NQO2克服非小细胞肺癌耐药性（国人佳作）

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编译：微科盟阿温，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读
肿瘤细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumornecrosis factor-relatedapoptosis-inducting ligand，TRAIL）的耐药性一直是临床肿瘤治疗的主要障碍。为了克服TRAIL的耐药性，本研究从食物来源的化合物库中鉴定发现姜黄素是一种新型的安全致敏剂，与TRAIL联合应用对非小细胞肺癌（NSCLC）具有协同致死作用。我们基于SILAC的细胞热位移来分析NRH:醌氧化还原酶2（NQO2）作为姜黄素的关键靶点。机制上，姜黄素直接靶向NQO2引起活性氧（ROS）的产生，触发内质网应激C/EBP同源蛋白（CHOP）死亡受体（DR5）信号，使NSCLC细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感。分子对接分析和表面等离子体共振分析表明，NQO2中的Phe178是姜黄素结合的关键位点。Phe178的突变完全消除了NQO2的功能，增强了TRAIL的致敏作用。本研究描述了NQO2在TRAIL耐药中的作用以及姜黄素通过直接靶向NQO2的致敏作用，强调了姜黄素作为NQO2抑制剂用于TRAIL耐药癌症临床治疗的潜力。

论文ID

原名：Curcumol Overcomes TRAIL Resistance of Non-Small Cell Lung Cancer by Targeting NRH: Quinone Oxidoreductase 2 (NQO2) 译名：姜黄素靶向NQO2而克服非小细胞肺癌耐药性
期刊：Advanced Science
IF：15.84发表时间：2020.10通讯作者：汪洋&何庆瑜
通讯作者单位：暨南大学

实验设计

实验结果

1. 姜黄素对TRAIL诱导的NSCLC细胞凋亡的敏感性研究
在NSCLC的临床试验中，我们经常观察到对TRAIL治疗的耐药性。我们比较了不同NSCLC细胞系（包括A549、H1299、H1975、H358和H460）对TRAIL激发的细胞活力。与先前的研究一致，A549和H1299对TRAIL表现出很强的抗性，而H460对25 ng/mL IC50的TRAIL敏感（图1A）。为了鉴定与高安全性试验治疗相关的协同致死化合物，我们筛选了52种来源于含有429种天然产物的药物库的食品源化合物（图1B）。为了获得最有效和最具选择性的化合物，阳性命中率被定义为在与TRAIL联合治疗中表现出高细胞毒性效应，但在单次治疗中表现出无毒性的化合物（图1C，表S1）。因此，姜黄素在与TRAIL联合治疗中表现出显著的协同致死效应（图1D）。然后，我们证实姜黄素的刺激以剂量依赖性的方式使A549和H1299细胞对TRAIL敏感（图1E）。在长期集落形成试验和Annexin-V-FITC/PI试验中，单独使用姜黄素（高达20×10⁵ M）或TRAIL（高达200 ng/mL）治疗对细胞生长和细胞活力没有影响（图S1A-C），但姜黄素与TRAIL联合使用时发现协同致死效应（图1F，G）。此外，我们发现通过提高姜黄素浓度直到40×10⁵ M，细胞活力仅受到轻微抑制（图S1D）。耐药NSCLC细胞对TRAIL的敏感性与外源性凋亡的增加相关，如Annexin-V阳性、cleaved-caspase3和cleaved-PARP的表达（图1H）以及细胞形态的改变（图S2A）。为了进一步证实姜黄素/TRAIL诱导的细胞凋亡，我们将A549和H1299细胞分别与姜黄素/TRAIL在泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK存在下共同孵育。结果表明，Z-VAD-FMK能有效地抑制姜黄素/TRAIL诱导的细胞死亡（图S2B），抑制cleaved-caspase3和cleaved-PARP的表达（图S2C）。此外，我们发现姜黄素单独或联合TRAIL对p53的表达没有影响（图S2D，E），这表明p53可能不参与姜黄素介导的协同致死效应。为了评价姜黄素/TRAIL联合用药的体内疗效，我们利用A549细胞建立了小鼠异种移植瘤，并检测了姜黄素低剂量（2 mg/kg）、中剂量（10 mg/kg）和高剂量（50 mg/kg）、单独和联合应用TRAIL（100 μg/只小鼠）的疗效。与体外研究结果一致，在高剂量（50 mg/kg）之前，单独施用姜黄素对负重肿瘤的影响可忽略不计，而与姜黄素和TRAIL的联合治疗以剂量依赖性方式诱导剧烈的抗癌作用（图2A），如肿瘤生长曲线（图2B）和肿瘤重量（图2C）所示。根据TUNEL染色结果（图2D），TRAIL和姜黄素联合使用比其他组诱导肿瘤细胞显著凋亡。重要的是，姜黄素/TRAIL联合给药不会对小鼠产生副作用，体重（图2E）和血液生化及血液学参数（包括白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总蛋白（TP）、血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）无明显变化即可证明（图2F）。重要器官的组织学检查，包括肝、肾、肺和心脏，没有发现任何明显的形态学变化（图2G）。这些数据表明姜黄素/TRAIL治疗对NSCLC有很强的抗癌作用，对动物没有毒副作用。图1 姜黄素是TRAIL诱导细胞凋亡的潜在增敏剂
A）通过提高浓度（高达200 ng/mL）用TRAIL处理NSCLC细胞24小时，并使用WST-1分析细胞活力。B）食品源药物库筛选流程图，以确定与TRAIL具有协同致死作用的化合物。C）姜黄素是诱导A549细胞TRAIL协同杀伤的首选药物。D）姜黄素的化学结构。E） A549和H1299细胞在姜黄素浓度升高的条件下孵育24小时，用所示浓度的TRAIL处理，然后用WST-1法测定细胞活力。F-H）用姜黄素（15×10⁵ M）和/或TRAIL（25 ng/mL用于A549，50 ng/mL用于H1299）处理A549和H1299细胞，然后分析其克隆形成能力（F），Annexinv-FITC/PI双染色法检测24h后凋亡细胞（G），Western blotting检测凋亡相关蛋白pro-PARP、cleaved-PARP、pro-caspase3和cleaved-caspase3的蛋白水平（H）。 图2 姜黄素和TRAIL联合治疗皮下肿瘤模型的协同抗癌作用
A）对照组和治疗组切除的A549肿瘤的代表性照片。B）肿瘤生长曲线显示姜黄素和TRAIL对异种移植瘤的协同抗癌作用。C）肿瘤重量的测定。D）用TUNEL法检测肿瘤组织中凋亡细胞的数量。E）监测治疗组和对照组裸鼠的体重。F）各组间血液化学无显著差异。G）肝脏、肾脏、肺和心脏H&E染色的代表性图像。 2. 基于SILAC的CETSA分析确定NQO2是姜黄素的关键靶点
接下来，我们建立了一个基于SILAC的CETSA图谱来鉴定与姜黄素直接相互作用的靶蛋白。这项技术是针对除了热变性蛋白和热变性后沉淀蛋白之外剩余可溶性靶蛋白的测量，它与SILAC的结合允许在局部生物系统中明确地鉴定靶蛋白。为了鉴定姜黄素的结合靶蛋白，我们用姜黄素或DMSO处理“light media”或“heavy media”培养的A549细胞1小时，然后高温使之变性，“light media”和“heavy media”的剩余上清液按1:1比例混合，用胰蛋白酶消化，然后进行质谱（MS）分析（图3A）。我们共鉴定出1147种蛋白质（表S2）；在推测的姜黄素靶点前20个（图3B）中，我们将注意力集中在NQO2上，因为NQO2的光/高比率以温度依赖的方式升高。经CETSA和基于等温剂量反应指纹分析的CETSA（^ITDRFCETSA）实验证实，姜黄素处理组NQO2的热稳定性以温度和剂量依赖性方式增加（图3C，D）。然后，我们使用荧光滴定实验来评估姜黄素和NQO2在体外的直接生理相互作用，并发现姜黄素添加到蛋白质中引起显著的荧光猝灭，平衡离解常数（Kd）=0.58×10⁶ M（图3E）。此外，我们的BANH分析和Western印迹分析显示姜黄素可以抑制NQO2酶活性（图3F），但不影响A549和H1299细胞中NQO2的蛋白表达（图S3A）。此外，我们发现姜黄素既不与醌氧化还原酶NQO1结合，也不抑制其酶活性（图S3B D），如荧光滴定分析（图S3C）和NQO1酶活性检测（图S3D）所示。这些结果表明姜黄素特异性地结合NQO2并抑制其酶活性而不影响其表达水平。图3 NQO2是姜黄素的潜在靶点
A）用于姜黄素结合靶点鉴定的SILAC定量CETS谱的实验设计。B）热图显示，在不同温度下，前20个推测蛋白质的光/高比率变化。C）比较细胞裂解液中姜黄素和对照组NQO2热稳定性变化的CETSA曲线。D）固定温度（67℃）下NQO2和姜黄素裂解液中的^ITDRFCETSA。E）荧光滴定法测定姜黄素与NQO2的相互作用。F）通过测定还原BNAH的吸光度来测定NQO2在姜黄素存在或不存在下的酶活性。 3. 姜黄素通过激活ROS-ER应激CHOP信号上调DR5
NQO2是一种黄素腺嘌呤单核苷酸（FAD）依赖的醌氧化还原酶，在细胞氧化还原循环和药物代谢中起着关键作用。据报道，当NQO2与某些小分子抑制剂直接结合时，可能产生ROS。例如，咪喹莫特可以靶向NQO2并抑制其活性，触发ROS产生。然后我们假设姜黄素可能诱导NSCLC细胞中的ROS-ER应激。首先，我们用二氢乙胺（DHE）进行分析，这是一种检测细胞活性氧（包括超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基）的探针，表明姜黄素可以剂量依赖性地诱导活性氧的产生（高达20×10⁵ M）（图4A）。有趣的是，活性氧水平在每个时间点（最多48小时）都适度增加（大约1.5倍的变化），这表明姜黄素刺激可以维持癌细胞中活性氧的慢性升高（图4A）。最近的研究表明，ROS诱导的内质网应激在CHOP-DR5的诱导中起着重要作用，因此我们研究了姜黄素是否能够促进ER-CHOP-DR5信号传导。如图4B，C所示，在两个用姜黄素浓度增加处理的NSCLC细胞中，内质网应激相关标记物包括热休克蛋白90（HSP90）、免疫球蛋白重链结合蛋白（BIP）、蛋白硫异构酶（PDI）和CHOP升高。CHOP基因敲除可减弱姜黄素/TRAIL诱导的A549和H1299细胞凋亡，这是由cleaved-PARP和cleaved-caspase3（图S4A，B）的拯救作用和Annexin-V阳性细胞群的积累（图S4C）支持的。这些结果表明姜黄素/TRAIL治疗的抗癌作用是必需的。DR5作为CHOP的靶基因，对TRAIL诱导的细胞凋亡至关重要。因此，我们研究了姜黄素对DR5表达的影响，通过使用DR5免疫荧光染色和Western印迹分析，我们发现姜黄素显著增加A549和H1299细胞中DR5的表达（图4D，E）。qRT-PCR分析证实，随着姜黄素浓度的增加，DR5的mRNA水平提高（图4F）。为了进一步研究姜黄素诱导的DR5转录激活需要CHOP，我们使用了两种荧光素酶报告质粒：含有DR5启动子序列区域（-552/+3）的pDR5/-552和含有在潜在CHOP结合位点突变的相同启动子序列的突变版本（pDR5/-552突变CHOP）（图4G）。我们对转染这些质粒的NSCLC细胞进行姜黄素处理，结果显示姜黄素处理增加了转染pDR5/-552质粒的A549和H1299细胞中DR5启动子的活性，但未增加转染pDR5/-552突变CHOP的A549和H1299细胞中DR5启动子的活性（图4H）。这些结果表明CHOP直接介导姜黄素诱导的DR5上调。在功能上，DR5表达的下调可以减弱姜黄素/TRAIL诱导的细胞凋亡（图S4D-F）。此外，我们在用增加剂量的姜黄素或与TRAIL联合治疗的肿瘤异种移植组织中观察到DR5和CHOP的上调（图4I）。总之，姜黄素激活CHOP-DR5信号，提高癌细胞对TRAIL的敏感性。图4 姜黄素诱导ROS/ER应激并激活CHOP-DR5信号
A）将A549和H1299细胞与姜黄素作用不同时间点，用DHE法检测细胞内ROS。B-C）两种细胞系用指定浓度的姜黄素处理，western blotting检测内质网应激相关蛋白，包括HSP90、BIP、PDI和CHOP。D）荧光显微镜下观察姜黄素处理后DR5的表达和细胞定位的变化。E，F）姜黄素诱导DR5的表达。姜黄素处理A549和H1299细胞24 h，western blotting（E）和qRT-PCR（F）检测DR5的表达。G）上图显示了含有CHOP结合位点的报告质粒中DR5启动子的结构示意图。下图显示了在含有CHOP启动子的报告质粒中引入的位点特异性突变。H）转染pDR5-WT或CHOP突变pDR5的NSCLC细胞经姜黄素处理后的荧光素酶活性。I）western blotting比较姜黄素、TRAIL及联合用药小鼠肿瘤中CHOP和DR5的表达水平。 4. NQO2调控的ROS对TRAIL诱导的肿瘤细胞凋亡敏感
为了确定ROS-ER应激信号是否对姜黄素/TRAIL在NSCLC中的抗癌作用至关重要，我们引入了ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）来降低姜黄素增强的ROS水平（图5A），并发现姜黄素诱导的ER应激可被NAC抑制，如HSP90、BIP和PDI（图5B）。阻断ROS还可以阻止姜黄素/TRAIL联合治疗诱导的癌细胞凋亡，如cleaved-PARP、cleaved-caspase3和Annexin-V-FITC/PI分析所示（图5C-E）。有趣的是，姜黄素/TRAIL增强的CHOP和DR5的表达也可以被NAC降低（图5C），这表明ROS是ER-CHOP-DR5信号传导的关键介质。然后我们使用两种针对NQO2的特异性siRNAs沉默NQO2，导致DR5、CHOP和细胞ROS的显著上调（图5F，G）。此外，在A549和H1299细胞中沉默NQO2可增强TRAIL存在下的凋亡死亡（图5H）。总之，这些结果表明NQO2调控的ROS是姜黄素/TRAIL诱导内质网应激和凋亡的关键介质。 图5 NQO2调控的ROS使癌细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感
A-E）NSCLC细胞经1×10^-3 M NAC预处理2 h，姜黄素与TRAIL共处理24 h，western blotting检测细胞内ROS（A）、内质网应激相关蛋白（B）和凋亡相关蛋白（C），流式细胞仪检测凋亡细胞（D, E）。F, G）用抗NQO2的siRNA或干扰siRNA（si-con）转染NSCLC细胞24 h，用western blotting法检测DR5、CHOP和NQO2的表达（F），用DHE法检测细胞ROS（G）。H）用si-NQO2处理TRAIL作用的A549和H1299细胞，western blotting检测细胞凋亡。 5. NQO2与NSCLC患者预后不良相关
基于NQO2介导的细胞氧化还原信号对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感的事实，我们假设NQO2在NSCLC的肿瘤发生和化疗耐药中起着关键作用。首先，我们利用Crispr/Cas9系统构建了A549和H1299的NQO2基因敲除（KO-NQO2）细胞系。集落形成试验和WST-1试验表明，与相应的对照组相比，KO-NQO2细胞的生长较慢（图6A，B）。为了观察NQO2在体内的作用，我们采用了由NQO2基因敲除细胞和相应的对照组形成的BALB/C裸鼠模型。KO-NQO2组的肿瘤体积和肿瘤重量明显小于对照组（图6C-E）。Ki-67染色进一步证实NQO2的缺失抑制了体内的肿瘤增殖（图6F）。然后，我们使用包含94例NSCLC患者组织样本的组织微阵列，通过免疫组织化学（IHC）染色研究了NQO2在NSCLC中的临床意义（图6G）。IHC染色显示，与邻近正常组织相比，小细胞肺癌组织中的NQO2显著升高（图6H，I）。此外，临床III期和IV期的NQO2评分高于I期（p=0.027，图6J），肿瘤NQO2表达水平与病理T期之间存在显著相关性（p=0.037，表S3）。Kaplan-Meier生存曲线显示，NQO2低表达的患者比NQO2高表达的患者生存时间更长（图6K）。综上所述，这些结果表明NQO2可以作为NSCLC患者的预后指标。图6 NQO2在非小细胞肺癌中的临床意义
A, B）进行集落形成和细胞增殖试验，以比较有无NQO2敲除的指示细胞系。C）裸鼠皮下注射指示细胞后肿瘤生长。每5天测量一次肿瘤体积（n=6/组），生长曲线和肿瘤重量总结如下表（D, E）。F）肿瘤Ki-67染色和NQO2蛋白IHC染色。G）采用IHC染色法检测94例NSCLC组织NQO2蛋白水平。H）图像代表NQO2的不同染色强度。I）肿瘤组织和配对非肿瘤组织中NQO2表达的IHC染色的代表性结果。根据评分分析NQO2的相对表达水平，结果显示为平均值±标准差。J）NQO2表达与临床分期之间的相关性在I期、II期和III/IV期之间进行分析，无显著性差异。K）94例NSCLC患者NQO2表达水平与总生存率的Kaplan-Meier分析。 6. 姜黄素在其活性位点附近与NQO2结合
了解姜黄素对NQO2的直接抑制作用后，我们进一步详细研究了NQO2与姜黄素的相互作用。我们通过AutoDock进行分子对接，选择结合自由能最低和得分最高的蛋白结构进行进一步分析（图S4A，B）。在硅对接分析中发现，姜黄素具有两个碳环，通过疏水键作用与NQO2催化囊中的Phe126、Ile128、Asn161、Phe178氨基酸残基相邻地结合在FAD的异四氧嘧啶环上（图7A，B）。在这四个潜在的结合位点中，Asn161和Phe178在空间上更接近姜黄素，距离为2.3Å（图7C），表明姜黄素结合的可能性更高。然后，我们通过分别突变两个氨基酸残基来研究NQO2蛋白的动态稳定性变化。我们首先用不同的突变模拟NQO2的碳骨架结构，结果显示Asn161或Phe178的突变没有显著改变均方根波动（RMSF）值和氨基酸之间的最小距离（图7D和图S5C）。圆二色（CD）光谱分析也证实，两个残基中的每一个突变对NQO2蛋白质的二级结构没有显著影响（图7E）。然后，我们对重组突变体蛋白NQO2^N161A和NQO2^F178A进行荧光滴定实验，发现两个突变体中的任何一个都没有与姜黄素相互作用（图S5D，E）。这些结果表明，NQO2蛋白中的Asn161或Phe178残基在结构上对姜黄素结合的贡献同样重要。为了探讨姜黄素结合对蛋白质活性的影响，我们利用两个突变体的模拟轨迹分析了分子动力学（MD），发现与野生型（WT）相比，NQO2的两个突变体表现出明显的波动（图7F），然后我们测试了两个NQO2突变体的酶活性，在纯化的重组蛋白和A549细胞裂解物中发现F178A突变比N161A突变显示出更大的抑制作用（图7G，H）。此外，SPR分析显示姜黄素以剂量依赖性方式与NQO2^WT结合；然而，随着姜黄素浓度的增加，重组NQO2^F178A蛋白未呈现明显信号（图7I）。总之，我们的数据证实Phe178是NQO2酶活性及其与姜黄素结合的重要氨基酸残基。 图7 姜黄素结合在NQO2活性口袋附近
A）NQO2之间相互作用的示意图(PDB:1ZX1型)用AutoDock分析姜黄素。B）基于电子对接分析预测NQO2中的相互作用氨基酸。C）绘制了姜黄素与预测的相互作用氨基酸之间的距离。D）四种NQO2蛋白和突变体（NQO2^WT（灰色）、NQO2^N161A（蓝色）和NQO2^F178A（红色））的RMSD值的时间演变。E）用CD光谱法测定了NQO2^WT和突变体（NQO2^N161A和NQO2^F178A）的二级结构。F）所有不同突变状态下NQO2的距离波动矩阵。两两距离波动的幅度用颜色编码，从蓝色（小波动）到红色（大波动）。G）体外NQO2酶活性检测。在底物K3（甲萘醌，10×10⁵M）、共基质BNAH（10×10⁵ M）和重组突变体NQO2蛋白（100 ng）存在下，用荧光法测定BNAH荧光的降低。H）细胞NQO2酶活性检测。分别用对照品NQO2^WT、NQO2^N161A或NQO2^F178A重新导入NQO2-KO细胞，并通过测量还原BANH的吸光度来确定NQO2在底物K3、BNAH和A549细胞裂解物（2.5 μg）存在下的反应进展。I）姜黄素（0-80×10⁶ M）与固定化NQO2^WT和NQO2^F178A缔合的代表性表面等离子体共振（SPR）传感图。 7. NQO2通过调节ROS水平介导体内TRAIL抗性
为了评估NQO2抑制是否有效地使癌细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感，我们在KO-NQO2 A549和H1299细胞中重新表达NQO2^WT和NQO2^F178A。如图8A所示，NQO2基因敲除上调了DR5、CHOP和细胞ROS水平，这些效应可通过NQO2^WT而不是NQO2^F178A的再表达得到逆转（图8A，B）。结果一致表明，具有KO-NQO2和NQO2^F178A再表达的细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感，而具有NQO2^WT再表达的KO-NQO2细胞对TRAIL表现出抵抗（图8C）。为了观察NQO2^F178A在体内的作用，我们将含有KO-NQO2和再表达NQO2^WT或NQO2^F178A的A549细胞经皮下移植到裸鼠体内，并用TRAIL处理。结果显示，与KO-NQO2类似，NQO2^F178A组对TRAIL治疗更敏感，如肿瘤生长曲线、肿瘤重量和TUNEL染色所示（图8D-G）。总之，姜黄素靶向NQO2并参与ROS驱动的ER-CHOP-DR5依赖性途径以克服NSCLC的TRAIL抵抗（图8H）。图8 失活的NQO2使癌细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感
A, B）用NQO2^WT或NQO2^F178A诱导NQO2-KO细胞，在TRAIL存在下，用免疫印迹法检测CHOP和DR5的表达（A），用DHE法检测ROS水平（B）。C）TRAIL诱导细胞凋亡相关蛋白的western blotting分析。D）在BALB/c裸鼠体内进行异种移植实验，注射A549蛋白，6天后给予TRAIL。统计绘制异种移植瘤生长曲线（E）和肿瘤重量曲线（F）。G）各组切除肿瘤组织进行TUNEL染色。H）姜黄素通过靶向NQO2致敏TRAIL诱导的细胞凋亡的工作模型。

讨论

姜黄素是从中草药姜黄中分离得到的一种主要的倍半萜类半缩酮化合物。受其显著的抗炎活性的启发，我们确定姜黄素是一种新的对TRAIL耐药的NSCLC细胞安全的增敏剂。姜黄素与TRAIL结合后，通过与NQO2相互作用激活ROS-CHOP-DR5信号，对NSCLC具有协同致死作用。药物靶点的确定一直是肿瘤临床研究的热点和挑战。目前的鉴定策略，如蛋白质氧化速率稳定性（SPROX）、药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）和基于活性的蛋白质分析（ABPP），只能适用于部分特定化合物。利用细胞热位移分析，我们首先将其整合到基于硅烷的蛋白质分析中蛋白质组学用于测量药物靶点结合的熔融转变。由此，我们准确地确定姜黄素直接与NQO2结合，残基Phe178作为主要功能配体，维持氧化应激并激活ROS-CHOP-DR5信号以克服TRAIL在NSCLC癌症治疗中的耐药性。据报道，NQO2催化醌类化合物的代谢还原，并对癌细胞中的外源性有毒物质提供细胞保护。例如，NQO2被报道催化内源性生物底物雌激素醌和褪黑素的还原，在细胞解毒中发挥关键作用。然而，Miettinen等人报道，NQO2是对乙酰氨基酚的一个非靶点，通过对乙酰氨基酚作为底物产生活性氧，表明NQO2介导的代谢可以在适当的底物可用时诱导活性氧爆发。其他几种外源性底物，包括白藜芦醇和槲皮素，通过抑制NQO2的酶活性表现出促氧化作用。咪喹莫特是Toll样受体7的小分子配体，能够与NQO2相互作用并抑制其活性，从而触发ROS爆发。我们目前的实验表明，姜黄素也可以直接与NQO2相互作用以诱导ROS信号。FAD的异四氧嘧啶环和周围的氨基酸残基对NQO2的催化囊至关重要。以前的研究提出伊马替尼和尼洛替尼可能与FAD竞争抑制NQO2的酶活性。但是，我们的对接分析表明姜黄素结合在催化囊附近，但不影响FAD。两个残基Asn161和Phe178在姜黄素的附着中起作用（图7C和图S5E）。然而，Phe178的突变对NnO2的酶活性表现出更深刻的抑制作用（图7G，H），这表明Phe178对于滞留进入催化腔的底物更为关键。据报道，NQO2参与了许多人类疾病，包括癌症和神经退行性疾病以前的研究表明，NQO2的缺失显示前列腺癌中增殖和G1期细胞积聚较慢NQO2对ROS的调节使我们推测其在NSCLC中的致癌作用。在这里，我们证明敲除NQO2在体内和体外抑制细胞生长（图6A-F）。NSCLC组织中的IHC染色进一步证实NQO2与总生存率呈负相关（图6G-K），表明NQO2可能具有基于其临床意义的治疗特性非小细胞肺癌。我们进一步关注NQO2在CHOP-DR5信号传导中的作用以及它如何介导TRAIL抗性。细胞ROS水平是DR5表达的关键介质，我们的体内和体外结果表明，NQO2缺失或失活突变（F178A）的细胞系表现出ROS生成，这是通过激活CHOP-DR5途径使癌细胞对TRAIL暴露敏感的一个重要信号（图8）。姜黄素治疗与TRAIL对NSCLC具有协同致死作用。考虑到姜黄素在日常饮食中的长期使用历史，我们认为姜黄素可能是一种理想的化学预防候选药物。姜黄素是倍半萜类化合物，家族成员较多。姜黄素可以激活NQO2，其他倍半萜类化合物是否对NQO2具有更高的活性和更好的选择性还有待探讨。有趣的是，我们发现姜黄素刺激可诱导慢性氧化应激和活性氧生成，这可能不足以激活内源性细胞死亡，但可适当触发CHOP-DR5信号传导（图S1B，C，图4）。这可以解释为什么姜黄素在目前的低剂量对癌细胞没有毒性作用，但与TRAIL联合使用时显示出协同致死效应。最近的研究表明，化疗药物上调DR5可以克服TRAIL耐药性，内质网应激可通过转录因子CHOP的反式激活，诱导DR5在多种人类癌症中的表达增加。CHOP与DR5启动子的5个非翻译区结合，启动DR5表达，以响应内质网应激诱导剂。这一发现为开发TRAIL增敏剂提供了线索。许多活性氧诱导剂，如毒胡萝卜素、蛋白酶体抑制剂（MG132和伊沙佐米）和植物化合物，被报道与TRAIL联合具有抗癌作用。然而，它们的稳定性和安全性仍然是临床应用的障碍。从食物源化合物中寻找新的化疗药物，与TRAIL协同治疗是保证其安全性和有效性的一个很有前途的策略。在这项研究中，我们成功地从食物来源化合物库中鉴定出姜黄素作为一种潜在的TRAIL受体激动剂。我们的体内外研究提供了确凿的证据，证明姜黄素通过催化位点直接调控NQO2，诱导CHOP-DR5信号传导，与TRAIL对NSCLC具有协同杀伤作用。癌细胞对TRAIL诱导的凋亡的抵抗仍然是临床试验失败的一个重要因素，这表明包含TRAIL的治疗只有在应用有效的TRAIL增敏剂时才会有效。基于我们的数据，我们提出姜黄素直接抑制ESNQO2酶活性引起ROS产生和内质网应激，通过CHOP依赖的方式触发DR5的表达。这一发现突出了姜黄素靶向NQO2治疗TRAIL耐药癌症的潜力。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33240775/

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