科研 | Nat. Commun.：原发性黑色素瘤网络模型微环境鉴定关键黑色素调控因子潜在的预后

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编译：微科盟向阳而生，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读黑色素瘤是一种致命的皮肤恶性肿瘤，在复杂的肿瘤微环境中受到遗传的表观遗传改变的驱动。而大规模的黑色素瘤分子图谱鉴别出的与黑色素瘤发展，多系统水平建模的分子标签仍然难以被阐明。本研究通过整合大规模高通量多组学和单细胞转录组测序数据，在原发性黑色素瘤中建立了预测的分子变化的基因网络模型。本研究将临床、表观遗传、以及蛋白组学数据整合得出一些关键的子网络，细胞类型，以及潜在的黑色素发展的调节因子。研究发现具有高免疫浸润特征的肿瘤与癌症良好的预后相关，据推测可能是由于CD8⁺T细胞毒性通过MYO1F介导的巨噬细胞所发生的M1极化过程所导致。17个关键的与较差预后的该基因子网的驱动因子，包括转录因子ZNF180，在体外被检测出具有促炎性效果。我们对ZNF180的抗肿瘤效果采用体内异种移植进行了进一步的证实。经试验证实，ZNF180的靶标在ZNF180为中心的网络中富集，并且是已知的黑色素瘤细胞维持以及免疫细胞渗透方面的通路，其关键调节因子的转录网络为黑色素瘤发生的分子机制提供了洞见并为开发黑色素瘤的治疗策略打下了基础。

论文ID

原名：Network models of primary melanoma microenvironments identify key melanoma regulators underlying prognosis译名：原发性黑色素瘤网络模型微环境鉴定关键黑色素调控因子潜在的预后
期刊：Nature Communications
IF：12.121发表时间：2021.02通讯作者：Eva Hernando，Bin Zhang
通讯作者单位：纽约大学格罗斯曼医学院，西奈山伊坎医学院

实验设计

实验结果

1. 对于原发性黑素瘤的整合生物学网络分析
我们采用基于高通量的原发性皮肤黑素瘤（pSKCM）RNA-Seq在The Cancer Genome Atlas（TCGA）组建了一个基因共表达网络模块（子模块）进行鉴别，并通过多尺度的植入基因进行共表达网络分析（MEGENA）（图1，补充图2A，B）。我们通过富集法共对221个基因模块中与生存相关的基因和所有已知的原发性黑素瘤特异性通路进行了优先分析（见“方法”）。在前10个排序的模块中，5个（M7，M597，M57，M46和M350）被富集在那些上调表达与细胞生存时间增加（GOSG）相关的基因中（补充图2B）而其它（M530，M22，M205，M204和M235；补充图2A）被富集在其上调表达与较差的预后相关的基因中（POSG）。通常，没有多少POSG富集模块与已知功能的通路相关，仅有1个POSG富集模块M22与一般性的由REACTOME分析的转录通路相重叠（校正Fisher’s精确检验p值（cFET p）= 3.45E^-54，13倍富集（FE）），这是由于锌指蛋白的共表达。相反，排在最前面的GOSG富集模块，M7（图1C；cFET p = 5.76E^-193，13.2FE）具有特征性的免疫学响应通路IFNγ的特征（cFET p = 4.95E-95，9.29FE），这些通路包括可通过NFκB进行的TNFα信号转导的（cFET p = 8.36E^-16，3.6FE）CTLA4通路（cFET p = 6.20E^-8，10.6FE），T细胞受体α通路（cFET p = 2.56E^-11，13.1FE）。在顺式-CpG岛位点几个基因在M7中的超级甲基化与其下调表达相关（cis-MCG：cFET p = 4.01E^-10，2.43FE）。作为直接和间接相互影响的基因表达和甲基化，我们对这些基因间的因果关系和突变的CpG岛位点进行分割。我们鉴别出PTPN6和PTPRCP是M7白细胞激活通路中的表观调控因子（见补充方法中导致较差预后表观沉默的T细胞激活；和补充数据6中表观调控网络）。
2. 上调的与良好的总生存免疫响应的子网络
此模块与良好预后具有最强的关联性，M7，是由反应不同免疫响应通路的子模块组成，包括白细胞激活（M110）和抗体递呈（M112，补充图3B）。M112捕获了PD1/PD-L1的信号通路，包括PD-L1以及几种PD-L1转录通路上的关键调控因子作为其节点，比如STAT1和IRF1。这种M112的免疫调控作用通过T细胞内PD1配体的富集进一步得到支持（cFET p = 1.62E^-21，16.6FE）。M7的这些节点与T细胞激活通路也具有相关性（cFET p = 3.86E^-10，40.2FE，补充数据3）。我们通过整合scRNA-seq数据切割了包括M7及其子模块在内的免疫细胞群体，该群体由来自19个黑素瘤病人（GEO 序列号：GSE72056）的4645个细胞组成。这些单独的细胞通过已发表的和推断出的细胞类型被注释，包括黑素瘤，T细胞（CD3+），巨噬细胞，内皮细胞，以及癌症相关的成纤维细胞。我们进一步将T细胞亚群分成CD8+细胞，CD4+T细胞，RMCD4_T细胞，以及M1-极化巨噬细胞（M1巨噬细胞）（补充图4A）。M7亚模块中的基因在不同细胞类型中表达，主要是黑素瘤细胞（在M401，M402，M110，M639和M642），M1巨噬细胞（在M400，M401，和M642中表达），B细胞（在M111中表达），CD8+T细胞（在M399，M401和M403中表达）以及CD4+T细胞（在M399，M401和M402中表达，补充图4C）。为了理解每一种细胞类型的互作，我们针对每一种细胞类型建立了一个共表达网络（标签为CLS1，CLS2等），称为sc-network（见补充图4B）。然后，我们评估了pSKCM网络和sc-networks用于鉴别上述细胞群体在高通量基因互作过程中的关系。例如，干扰素-γ（IFN-γ）响应M401模块和M402显著重叠了在CLS3 sc-network（cFET p = 9.48E^-20）巨噬细胞-富集模块。该结果反映了IFN-γ可作为一种的巨噬细胞的激活因子。来自pSKCM网络的MYO1F附近显著富集在CLS3网络的MYO1F附近（图2A；cFET = 2.12E^-6，211FE；补充图4G）。在单细胞转录组中，MYO1F在M1巨噬细胞和33个黑素瘤群体中IFN-γ-分泌的CD8+ T细胞中持续表达（图2B；补充图5B；补充图6）。这些MYO1F^highM1巨噬细胞表达的PD-L1（图2B中的CD274），以及MYO1F^highCD8+T细胞显示IFN-γ的高表达（图2B中的IFNG）。假设M1巨噬细胞为促炎性，并且与细胞毒性CD8+T细胞互作，这些结果表明MYO1F可能在原发性黑素瘤IFN-γ/PD-L1信号转导中起到关键作用。这些来自单细胞转录组中的发现与来自pSKCM高通量RNA测序数据一致。MYO1F与pSKCM中推断的M1巨噬细胞丰度有关但是与M0-/M2-巨噬细胞无关（图2C）。Thorsson等发表的pSKCM样本免疫亚型的改变明确了哪种免疫亚型与MYO1F相关。MYO1F显示出IFNγ主要亚型C2（补充图7A）的高表达并与M1/M2巨噬细胞比例和C2内CD8+T细胞丰度具有一定的相关性。与这些观察一致，MYO1F被鉴定为上游转录因子并且超激活了巨噬细胞STAT1，通过刺激细胞间粘附导致M1极化和IFNγ分泌。MYO1F可能也调控了白细胞。MYO1F在两个批量群体中与T细胞共抑制受体PD-L1相关（图2D）。PD-L1上游基因比如IRF1和STAT1在MYO1F^highM1巨噬细胞中表达量比CD19+单核细胞/巨噬细胞更高（补充图6）。为了证实在pSKCM网络中捕获的巨噬细胞IFNγ响应的子网络，我们组织了关键的IFNγ响应通路调节因子STAT1中丧失功能的（LoF）印记通过查询GREED数据库后寻找骨髓源的巨噬细胞（BMW）敲除的（Stat-KO）小鼠（GSE48970）完成。正如所期望的，这些来自Stat1敲除BMW的下调的基因在STAT1为中心的pSKCM子网络中富集（补充图3C；cFET p = 2.80E^-31，34.6FE）。进一步的，STAT1的表达与通过pSKCM中CIBERSORT推断的M1巨噬细胞丰度相关（ρ = 0.59，p = 4.28E^-11；补充图3E）。这些结果支持STAT1为中心的描绘IFNγ响应pSKCM巨噬细胞的网络。总之，MYO1F可能通过STAT1/IRF1/PD-L1轴，调控了M1巨噬细胞和细胞毒性CD8+T细胞的IFNγ响应过程。图1 TCGA中原发性皮肤黑色素瘤群体共表达网络分析的分析性流程图
A）总体工作流程。B）来自TCGA的原发性黑素瘤样本的共表达网络。采用缺省的分辨率参数α=1鉴别出的基因模块用不同的颜色表示。高度连接的节点基因采用相应的基因符号标记。C）通过生存分析获得的热图代表的与前30个具有相应分子特征的基因模块。热图颜色代表相应基因印记在此模块中的富集情况。GOSG代表pSKCM中具有良好预后的相关基因以及/或者转移性黑素瘤（mSKCM）群体。POSG包括了在pSKCM和/或者mSKCM群体中与较差预后相关的基因。DEG-UP和DEG-DN为与邻近的正常组织相比较上调和下调的肿瘤基因印记。MCG代表甲基化相关基因（MCG）。甲基化相关基因和一个CpG位点之间具有正（负）相关关系被称为阳性（阴性）MCG。基于相应的CpG位点的位置以及基因在基因组上的位置，MCG也被归为顺式或者反式调控。
3. 体内肿瘤DNA修复和与较差预后相关的mRNA剪切通路的上调
我们进一步对排名最靠前的与较差预后相关的模块进行特征分析，包括M530，M22，M205，M204和M235（补充图2A），虽然这些模块与已知的NSigDB的通路和功能不相关。这些模块中的节点基因包括已知的mRNA剪切前体的调控因子，比如丝氨酸-精氨酸蛋白样因子，SFRS3，以及SFRS13A，这些基因是M235的节点；同时一种剪切体相关的蛋白，SR140为M530的节点。M205包括了一种核孔组分（NUP205）和一种剪切因子（TNPO3）；M22节点包括DNA修复调控因子比如FANCM（一种Fanconi贫血核心复合物），以及ZNF180，具有一个与异常基因组重组相关的位点。有趣的是，FANCM和ZNF180基因表达与一种来自反相蛋白芯片（RPPA）数据集的MSH2（补充数据9）的DNA错配修复蛋白（其ρ = 0.530（校正p = 4.53E^-2）以及0.529（校正p = 4.48E^-2））相关。在黑素瘤中，高表达的DNA修复基因（包括MSH2）与肿瘤转移相关并且可能可以解释其通过维持遗传稳定性对化疗和放疗的抗性。这些数据表明DNA修复和mRNA剪切通路与原发性黑素瘤的较差预后相关。为了鉴别原发性黑素瘤预后的调控因子，我们检查了之前鉴定出的前10个模块的节点基因之间的交集以及较差的预后特征图3A）。基于Achilles数据库中CRISPRi筛选数据，我们以这种模式命名了18种调控因子，这些调控因子对于黑素瘤细胞活力相比较差预后标签而言更加关键（Wilcox p = 3.03E^-4；补充图10）。这些潜在调节蛋白的基因表达谱与通过ESTIMATE推断的肿瘤纯度评分相关，作为肿瘤细胞内在基因对其进行支持（补充图9），如CIBERSORT（补充图9）；这些肿瘤中关键调控因子的较高表达与较低的CD8⁺T细胞渗透性相关，表明这些基因的细胞内表达与细胞毒性T细胞的低渗透相关。因此，这些预测的调节因子基因捕获了与肿瘤生存能力相关的必要的通路并且对早期黑色素瘤表现出较差的预后。图2 MYO1F作为IFN-γ在原发性黑素瘤微环境中响应的潜在调控因子
A） POSG富集模块网络，M401。在一个节点中的饼状图大小在细胞类型上与相应基因的特异性成比例，并且这些细胞被预测属于该种细胞类型。对于每个基因的富集评分通过所有7种细胞类型的富集评分之和进行标准化。具有FET FDR < 0.05的细胞类型以饼图形式表示。饼图颜色表明不同的细胞类型：（RM）CD4 T细胞（深棕色），CD4 T细胞（浅绿色），M1巨噬细胞（天蓝色），B细胞（深李色），黑色素瘤（深红色），内皮细胞（绿色）。B）MYO1F在M1巨噬细胞和CD8T细胞以及PD-L1（CD274）中表达，来自GSE72056和Jerby-Arnon等的scRNA-测序数据集的tSNE作图显示巨噬细胞标记（CD14）的顺时针表达与CD8 T细胞标记（CD8A）与MYO1F，INFγ（IFNG），以及PD-L1（CD274）同时进行。表达水平的尺度的log2（TPM+1）值在底部显示。C）在pSKCM和Van Allen等作出的MYO1F和CIBERSORT散点图推断的巨噬细胞群体（M0-M2）。在MYO1F和巨噬细胞间的Spearman相关的95%置信区间对于M0为（-0.29，0.33），对于M1为（0.036，0.59），对于M2为（-0.11,0.49）。D）在Van Allan等2015年的群体中，MYO1F表达和PD-L1（CD274）/INFγ（IFNG）的Spearman相关。点的大小与推断的M1巨噬细胞丰度成比例。对于CD274以及pSKCM中的IFNG的95%的置信区间为（0.12，0.47）和（0.42，0.69）。CD274和IFNG在Van Allen等2015年群体中的置信区间为（0.25，0.72）以及（0.30，0.74）。
4. 较差预后候选网络驱动因子的系统证实
为了证实18个分子网络潜在的原发性黑素瘤预后的候选调控因子，我们在SKmel147中（NRAS突变体）和A375（BRAF突变体）细胞系中进行了siRNA敲除试验（见在补充方法中siRNA筛选的候选靶标）。在18个候选基因中，第17个候选基因的siRNA对于后续高通量筛选分析和评估细胞生长和入侵的影响是可行的。相对于非靶标性的对照组（NTC），siRNA介导的5个基因在SKmel147细胞中的敲除（KRIT1，ZNF680，SRSF10，ZNF180，以及TMEM160B）可显著的降低细胞生长（p < 0.05）（图3B，顶端）。敲除位于SKmel147细胞中的8个关键调控因子（PPPIR2，G2E3，MKLN1，ZNF225，ZNF180，ZNF347，KRIT1，以及U2SURP（SR140））可显著的降低入侵（图3B，中间图）。一种相似的对于A375细胞的siRNA入侵筛选在5个基因中产生了显著的差异：TBC1D23，PPP1R2，ZNF180，MYNN，以及ZNF347（图3B，底端）。总之，我们证实了在SKmel147和A375细胞中（表1）17个候选调控因子中13个的促肿瘤发生效果（76.4%），发现肿瘤间信号通络对肿瘤生存能力是必要的并且在原发性黑素瘤中传递了差的预后信号。
5. ZNF180沉默拮抗黑素细胞增殖以及体内和体外的入侵
在13个得到成功证实的功能性候选基因中，PPP1R2（M530的节点），ZNF180，以及ZNF347（M22的节点）显示在多个siRNA功能分析中的稳健效果。对于PPP1R2，ZNF180以及ZNF347的瞬态损耗显著降低了体内SKmel147和A375细胞的入侵能力。较低的ZNF180转录本和蛋白质水平证实了有效的shZNF180-SKmel147细胞相对于shNTC转导的对照组细胞（补充图14）被敲有效的干扰。SKmel147细胞稳定的采用对照（shNTC）或shZNF180表达的慢病毒进行感染，这些慢病毒被注射进入NDO/Shi-scid/IL-2Rgamma缺失（NSG）小鼠（n - 12/组）。我们采用shZNF180转导细胞注射的小鼠，并且对这些小鼠在注射终止时进行称重（p < 0.0001），同时与注射携带非靶标性shRNA（图3D-G）的小鼠进行比较，发现这些小鼠表现出显著下降的肿瘤生长情况（p <0.0001）。上述实验结果支持了ZNF180在黑素瘤体内生长过程中的作用。总之，我们的数据表明ZNF180对于黑素瘤体内和体外的生长是非常关键的。RNA测序显示由ZNF180在SKmel147细胞沉默过程中引发的转录水平上的变化（见补充方法中RNA测序）。响应ZNF180差异表达基因（称为siZNF180-DGEs；补充图数据8）在pSKCM网络的ZNF180子网络中采用无阈值秩-秩超几何重叠检测进行显著富集（见siRNA敲除SKmel147细胞中对RNA测序数据的分析，补充方法；补充图11E）。不仅如此，这些基因通过siZNF180被富集在pSKCM网络ZNF180的四层网络附近（补充图12A；cFET p = 1.41E^-83，3.69FE），因此证实了pSKCM基因网络的拓扑结构。这些发现在肿瘤转移SKCM（mSKCM）的共表达网络分析以及Van Allan群体（补充图12B）中进行重复。
6. ZNF180是一种原发性黑素瘤发病原因的多功能驱动因子
SiZNF180-DEGs与几种癌症和pSKCM预后中异常的信号转导通路相关。下调基因（siZNF180-DN）显著与pSKCM-POSG（cFET p = 2.15E^-6，3.60FE）。重叠。上调基因（siZNF180-UP）显著的与pSKCM中预后良好的基因标签重合（FET FDR = 7.32E^-54，2.03FE），其交叉点与一般的免疫系统通路相关（cFET p = 6.37E^-3，2.64FE）。我们进一步检查了ZNF180和来自RPPA的蛋白质表达之间的潜在相关性以鉴定候选的互作蛋白质。错配修复蛋白MSH2的表达，以及血纤维蛋白原激活因子抑制剂，PAI-1，与ZNF180的表达相关系数ρ = 0.54（调整 p = 4.48E^-2）以及-0.44（校正p = 4.83E^-2）显著相关。MSH2与通过siZNF180下调基因在蛋白质-蛋白质互作网络中发生密切互作（图3H）。我们假定MSH2和黑素瘤细胞的DNA修复在维持肿瘤细胞遗传稳定性方面具有作用，这些数据表明ZNF180可能在调控促肿瘤发生通路方面发挥作用。富集siZNF180-DGEs的基因模块更加全面的捕获由ZNF180控制的信号通路。这些通过siZNF180富集在上调表达基因中的模块包括肿瘤抑制因子和阴性细胞周期调控因子（M597；补充表1）。相反，这些被siZNF180干扰而表现出下调的基因与DNA修复相关，这些基因包括上皮间充质转移（M25），肿瘤发生（M24，M25和M257），mRNA前体剪切（M25和M30），蛋白质修饰/降解以及染色质修饰/重塑（图4D；见补充方法中体外SKMEL147细胞中通过ZNF180抑制差异表达通路）。值得注意的是，M25作为一种被ZNF180调控的核心模块出现，它不仅富集了siZNF180下调的基因，也富集了来自pSKCM较差预后的标记（图4D）。M25与肿瘤信号转导通路相关，包括MYC靶标（标志物MYC靶标V1：FET FDR = 9.43E^-4，2.58FE）。M25也作用于连贯的蛋白质互作网络，该网络由STRING数据库中具有高置信度的互作关系组成（> 70%的置信度；图3D）。这些M25内互作网络基因，包括诸如ROCK1，PIK3CA，RHOA的癌症基因在内的蛋白质互作网络以及关键的DNA修复调控因子比如MSH2和ATR（图3D）。这些结果表明了在原发性黑色素瘤中DNA修复信号转导和癌症基因信号转导通路之间的互作。为了理解受到ZNF180调控的细胞群体，我们采用在R安装包中的“scBio”细胞群体作图（CPM）算法从黑色素瘤单细胞转录本研究中去整合了pSKCM批量样本到体外细胞类型中。在两个GSE72056（图4C）以及Jerby-Arnon等进行的研究，ZNF180的表达与增加的癌症相关的成纤维细胞一致并在两个研究中降低了（补充图5D）M1巨噬细胞的丰度。总之，我们的结果表明ZNF180是一种多功能癌症驱动和DNA修复因子，可能也通过M1巨噬细胞和癌症相关的成纤维细胞调控了肿瘤的渗透。图3 对于ZNF180作为原发性黑素瘤中一种有前景的靶标的系统性的鉴定和证实
A）来自pSKCM（pSKCM-POSG）较差生存基因标签的交叉点，以及前10个模块的中心。上述18个被命名为pSKCM-POSG的节点也被提名为siRNA筛选的基因。B）对于提名的靶标siRNA扩增筛选（顶部）和入侵（中间）进入SKmel147的siRNA，以及入侵进入A375细胞的siRNA（底部）的热图。热图显示-log10（t检验p值）标记的siRNA筛选结果的显著性，这些显著结果通过点进行表示。红色矩形强调了持续被证实的一些基因（ZNF180，ZNF347和PPP1R2）。C）对于SKmel147和A375的孔间基质入侵分析采用siNTC或者siZNF180，siZNF347以及siPPP1R2进行转导。入侵的细胞通过8和6h后对入侵进入基质胺包被的基面孔间插入SKmel147和A375细胞，n = 5个视野每个重复；3个重复每种情况，如图为代表性结果。相应的比例尺为100μm。D）生长曲线代表了注射shNTC或者shZNF180转导的SKmel147细胞的小鼠平均的肿瘤体积（n = 12每组）。肿瘤体积。E）以及肿瘤质量F）以及G）注射后13天切除获得的肿瘤图像。在（D-F）中，数据采用平均值 ± 标准差表示。***注释了通过两尾非配对t检验获得的显著性，p < 0.0001。H）M25捕获了STRING数据库中的标注的蛋白质互作，其置信评分为 > 70%。节点颜色和边界颜色通过siZNF180（sIznf180-DEG）标注了差异表达基因，pSKCM生存标签采用图例表示。
图4 黑素瘤中ZNF180调控通路的分解
A，B） ZNF180表达（x轴）和蛋白质表达（y轴；A：MSH2，B：PAI-1）之间的相关性。点的颜色表明病人在整个生存过程中的预后（3年之内死亡的患者：红色，其它为黄色）。C）细胞丰度与ZNF180在pSKCM中的表达相关。与注释的细胞类型（x轴）丰度相关的4645个细胞的相对丰度通过scBio包中细胞群体作图（CPM）算法与103个pSKCM样本相关。针对相关性推断的丰度通过ZNF180在pSKCM中的表达被进行检测。每一个点代表来自scRNA-seq中在pSKCM中表达ZNF180的单个细胞的相对丰度之间的相关性。x轴是相关细胞的细胞类型，y轴是通过Spearman相关系数标记的-log10（FDR）。红色水平线标记FDR = 0.05阈值，红色三角代表相关性最高的细胞类型。箱图的边界表示两尾1/4，中位数，而跨度趋向最小值和最大值。D）总结与ZNF180潜在调节模块相关的通路。模块中富集的标签为红色。
图5 通过批量pSKCM和单细胞基因网络捕获的原发性黑素瘤的关键信号通路
A）MYO1F介导的巨噬细胞的M1极化与良好的预后相关。与CD8+T细胞接触导致了IFNγ在肿瘤微环境中分泌的增加。B）ZNF180过表达驱动了DNA修复和下游的黑素瘤通路并抑制了巨噬细胞通过PAI-1蛋白质表达的渗透作用。

讨论

本研究构建了批量单细胞RNA测序结果的多尺度基因网络，并发现单细胞RNA-Seq数据以分割复杂的互作共调控潜在的原发性黑素瘤的产生。我们的分析结果表明大量的通路和潜在的原发性黑素瘤调控因子及其微环境。免疫响应模型，M7的上调，是一种强阳性的预后因子并与增加的CD8+T细胞和M1巨噬细胞相关。相反，子网络中较差预后结果表明肿瘤间DNA修复通路具有预测性的调控因子。我们通过siRNA体外敲除实验系统的检测了17个候选基因的抗肿瘤效应。ZNF180具有最一致的抗肿瘤效应并且在体内被进一步进行验证。通过MEGENA进行鉴定的关键癌症模块网络驱动因子是很多其它基因的潜在调控因子，而网络为这些调控因子发挥作用提供了功能性环境。而传统的预后分析提供了一系列的预后性基因鉴别已知的富集通路，这些分析受到原有知识的局限，限制了新的疾病通路发现。相反，基于网络的发现提供了诸如补充传统方法基因模块的观点（即，新的通路）以及节点（即，潜在的调控因子）。鉴别MYO1F和ZNF180及其内在网络模型支持了本研究中采用的整合性网络手段。值得注意的是，MYO1F作为一种巨噬细胞内潜在的调控因子出现。MYO1F是一种在基于高通量的pSKCM网络中具有影响力的节点（即，在M401节点中的最高节点）以及来自单细胞转录组数据中促炎性的M1巨噬细胞簇网络（即，在M1巨噬细胞富集的细胞簇中的节点）。我们证实了在黑色素瘤单细胞转录组数据M1巨噬细胞群体中高的MYO1F的表达。这些数据表明MYO1F通过在M1巨噬细胞中STAT1被激活而发挥作用。在INFγ通路中发挥了作用， MYO1F通过激活STAT1，一个相同的免疫响应模块M76中的节点基因，调控了肠粘膜巨噬细胞中M1极化。该通路内高INFγ分泌的细胞与MYO1F在以INFγ为主的微环境中免疫亚型上调一致。为了建立STAT1在此黑素瘤细胞内的作用，我们开发了来自pSKCM的STAT1为中心的网络模型，并且采用BMW中Stat1敲除小鼠模型STAT1干扰标记进行切割。我们观察到在STAT1为中心的网络和来自BMW的STAT1干扰标记之间的重叠（补充图3C）。STAT1的表达与推断与pSKCM中CIBERSORT的M1巨噬细胞丰度相关（ρ = 0.59，p = 4.28E^-11，补充图3E）。由于在pSKCM中仅有一个肿瘤具有体细胞STAT1突变，我们没有能力确定STAT1突变和M1巨噬细胞丰度之间的关系。因此，STAT1为中心的网络代表了巨噬细胞STAT1通路中详细的基因互作。在给定STAT1和MYO1F之间密切的互作关系的条件下（ρ = 0.32，p = 9.88E^-4），这些观察值也支持了在M1极化和STAT1在巨噬细胞激活中MYO1F的调控作用，导致了IFNγ在黑素瘤微环境中的分泌。这些数据也表明MYO1F可能在原发性黑素瘤微环境的获得性免疫系统内调控CD8⁺T细胞和M1巨噬细胞潜在激活的在互作过程中发挥了作用。MYO1F mRNA在一个独立的黑素瘤高通量转录组数据集中（图2D）的表达与IFNγ显著相关（即IFNG）。在单细胞转录组数据中，IFNγ在CD8+ T细胞和M1巨噬细胞（图2B）中表达。事实上，M1巨噬细胞和CD8+ T细胞本身的共定位能够诱导CD8+ T细胞产生IFNγ，增强其活性和细胞毒性。总结MYO1F在驱动M1极化过程中的调控作用，IFNγ和MYO1F在批量RNA测序数据集中的相关性可能反映了由于MYO1F介导的M1极化所增强的细胞毒性，从而反过来增加M1巨噬细胞和CD8+ T细胞的共定位。共抑制的T细胞周期检查点，PD-L1的高表达，也被发现与pSKCM的良好预后相关联（log-rank p = 1.32E^-2）。虽然PD-L1的增加与细胞毒性T细胞的抑制密切相关并且因此促进了实体肿瘤的免疫防御逃逸，其高PD-L1表达的预后意义在某种程度上具有争议。在实体肿瘤较宽的谱系中，一些研究报道了高PD-L1与较差的结果相关，而在转移性黑素瘤中高PD-L1与较高的渗透性T细胞含量以及较好的预后相关联。在我们的研究中，高PD-L1可能反应了塑造IFNγ主导的微环境中MYO1F^highM1巨噬细胞的丰度，表明它们可能是PD-L1的主要来源。有趣的是，CD274（即PD-L1表达）和IFNG（即IFNγ）之间的关联（图2D）也反应了高PD-L1是IFNγ主导环境中的一个标记物。总之，MYO1F-PD-L1/PD1-IFNγ轴被鉴别为包括所有IFNγ产生和细胞毒性T细胞抗肿瘤活性的预后通路。在17个来自pSKCM网络提名的靶标中，ZNF180显示出最为一致的促肿瘤效应（图4D）。与通过敲除ZNF180导致的黑素细胞DNA修复通路抑制一致，该模块主要由siZNF180，M25所调控，具有包括MSH2和包括PIK3CA，Rho 激酶，以及GTPases在内的肿瘤DNA修复通路。事实上，在原发性黑素瘤中MSH2的过表达与较差的预后相关，可能是通过使肿瘤细胞扩增和转移而实现。相反，几个通过沉默ZNF180的模块包括肿瘤抑制因子比如BRMS1和GADD45GIPI作为节点基因。在pSKCM中，PAI-1蛋白的表达与ZNF180的表达呈现负相关。PAI-1被显示可促进巨噬细胞在黑素细胞中磷酸化的FAK-Tyr渗透（图5B），表明ZNF180可能也调控了免疫细胞在原发性黑素瘤中的渗透。综上所述，本研究从原发性黑素瘤的多个方面鉴别出了肿瘤发展和免疫逃逸的轴，包括增强的CD8⁺ T细胞毒性可通过MYO1F介导的巨噬细胞M1极化，同时ZNF180作为DNA修复和免疫细胞在黑素瘤细胞中渗透的调控因子。这个网络模型揭示了一些本研究以外未被完全揭示的模型。采用免疫组分模型进行的研究（比如，遗传和表观遗传调控）需要研究者更多的理解黑素瘤极化调控因子在肿瘤发展和免疫调控方面的功能影响（例如MYO1F和ZNF180）。表1 与原发性黑色素瘤预后相关的关键基因列表^a 来自入侵后筛选进入SKmel147细胞中并得到证实的基因。
^b来自入侵后筛选进入A375细胞并得到证实的基因。^c来自增殖筛选后进入SKmel147细胞中并得到证实的基因。节点的连通性（比如：一个基因）是一系列与TCGA-pSKCM共表达网络一致的连接。Cox P（即Cox P值）来自于两侧Cox预期危险模型中相应基因的表达量。Log-rank P （即log-rank P 值）来自于通过不同组病人相应基因表达量中位数两侧log-rank测验结果。该模块表明相应基因的基因模块成员。黑体字强调的基因通过对转染相应siRNAs的SKmel147细胞RNA测序被选择作为比较转录组分析的基因。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33619278/

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