科研 | Nat. Commun.：免疫突触细胞骨架网络的表观遗传调控增强γδT细胞介导的肺癌细胞毒作用

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编译：微科盟李可爱，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读
γδT细胞是T细胞的一个独特亚组，连接先天性和适应性免疫系统，并且可以不受MHC限制地攻击癌细胞。在实体瘤中，过继性γδT细胞转移的试验取得了初步成功。在这里，我们使用定量蛋白质组学研究显示，DNA甲基转移酶抑制剂（DNMTis）可上调与γδT细胞活化相关的癌细胞表面分子。DNMTi对人肺癌的治疗作用，可通过离体扩增富含Vδ1的γδT细胞来增强肿瘤溶解。从机制上讲，DNMTi通过协调DNA甲基化和染色质可及性改变来增强免疫突触的形成并介导细胞骨架的重组，粘附分子的遗传耗竭或肌动蛋白聚合的药理抑制作用消除了DNMTi的增强作用。在临床上，与DNMTi相关的细胞骨架特征可对肺癌患者进行预后分层，这些结果支持DNMTis和基于γδT细胞的免疫治疗在肺癌治疗中的组合策略。

论文ID

原名：Epigenetic modulation of immune synaptic-cytoskeletal networks potentiates γδT cell mediated cytotoxicity in lung cancer译名：免疫突触细胞骨架网络的表观遗传调控增强γδT细胞介导的肺癌细胞毒作用
期刊：Nature Communications
IF：12.121发表时间：2021.04通讯作者：余忠仁；蔡幸真
通讯作者单位：国立台湾大学医学院

实验设计

在本研究中，我们显示DNMT通过基于细胞培养（SILAC）的定量蛋白质组学中的氨基酸进行稳定的同位素标记，显着改变了肺癌细胞的表面蛋白质组。这些实验表明，低剂量瞬时DNMTi处理后，多个不受MHC限制的免疫识别分子上调。DNMTi诱导的表面蛋白质组的基因本体分析显示，上调的分子与γδT细胞活化高度相关。我们证明了癌细胞的DNMTi处理增强了离体扩大的同种异体γδT细胞和癌细胞之间的免疫突触形成，并增强了γδT细胞的抗肿瘤免疫力。DNA甲基化，mRNA-seq和Omni-ATACseq的全基因组组合分析揭示了免疫突触细胞骨架网络的协调表观遗传调控模式。另外，我们通过γδT介导的细胞毒性反应的免疫细胞骨架模型对原发性肺癌组织进行分层，这可能有助于在将来进行精确免疫治疗的临床试验，我们的研究支持DNMTis重塑癌细胞骨架在基于不受MHC限制的γδT细胞疗法中的广泛应用。详细研究流程如下：

实验结果

1.DNMTi上调与γδT细胞活化有关的表面分子
两种FDA批准的DNMTis，包括胞苷类似物地西他滨（Dacogen，DAC）和阿扎胞苷（Vidaza，AZA），它们掺入DNA/ RNA中并通过不可逆的酶结合作用而消耗DNMT，随后使蛋白酶体降解。DNMTis已被证明可在转录组水平上调节不同癌症类型有关抗原的加工/呈递，包括人类白细胞抗原（HLA）和干扰素反应的相关途径。然而，转录组的变化可能不能完全反映表面蛋白的变化，造成无法探求免疫治疗易感性的原因。因此，我们试图通过使用EZ-link磺基-NHS-SS生物素辅助生物素化方法来解决问题，我们使用基于SILAC的定量蛋白质组学方法(图1a)，从A549人肺癌细胞中分离细胞表面蛋白，获得由地西他滨(DAC)改变的表面蛋白的综合图谱。我们采用了在我们之前的研究中建立的低剂量治疗方案，以证明药物对细胞毒性的表观遗传效应。首先，通过在含有重精氨酸(L-精氨酸-13C6)/赖氨酸(L-赖氨酸-13C₆)或正常精氨酸/赖氨酸的细胞培养基中，对肺癌细胞进行差异标记。我们分别用磷酸盐缓冲盐水和100纳米DAC处理SILAC标记的细胞(重)和未标记的细胞(轻)，连续三天(D3)，并在无药物培养基中再生长三天(D3R3)(图1b)。在细胞表面蛋白质生物素化后，我们将在D3和D3R3的DAC处理的细胞的总细胞裂解物与它们相应的模拟处理的对应物1∶1混合，并进行表面蛋白质分离，然后进行定量蛋白质组学。我们在D3和D3R3分别鉴定了A549细胞中666和831个基因本体注释的表面蛋白(对应于8791和11，898个独特的肽)(图1c)。停药后已鉴定的表面蛋白的持续增加与我们之前关于短暂药物暴露后表观遗传记忆效应的报告一致。在所有鉴定的蛋白质中，我们集中于314种蛋白质，它们在DAC治疗后显示出D3和D3R3至少1.4倍的持续上调，因为它们在停药后的持续诱导暗示了一种可能的表观遗传调节(图1d)。除了先前已知由DAC上调的MHC分子和某些免疫检查点蛋白之外，我们还发现了大量参与先天免疫或MHC非限制性免疫的蛋白，如MHC类多肽相关序列A和B(即MICA，MICB)，它们是γδT和NK细胞上NKG2D的配体(图1e)。DAC还上调UL16结合蛋白2和3(即ULBP2和ULBP3)，ULBP2和ULBP3是在许多癌症和应激/损伤组织中表达的另一组NKG2D配体(图1e)。这些分子已经被先天免疫系统确定为肿瘤免疫监视的目标，并且可以在不需要常规MHC限制抗原呈递的情况下引发抗肿瘤免疫。此外，作为免疫监测的一部分，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的两种死亡受体(即TRAIL1和TRAIL-R2)在D3R3显著上调(图1e)。有趣的是，对另外两种人肺癌细胞系H1299和CL1-0中基于SILAC的表面体分析表明DAC诱导的表面蛋白高度相似。在所有三种D3R3肺癌细胞系中，DAC通常上调431种蛋白质（图1f）。DAC诱导的表面分子参与先天免疫应答是显而易见的，我们针对InnateDB的先天免疫相互作用基因组映射了这些蛋白质，InnateDB是先天免疫途径和相互作用的广泛数据库。我们发现了DAC介导的先天免疫分子，它们参与粘附/细胞间相互作用（例如，CD97和ICAM-1），细胞骨架（例如，ARPC2和VASP），热休克蛋白反应，整联蛋白相关的途径以及各种信号转导网络（图1g）。接下来，我们在DAC诱导的表面蛋白质组上使用PANTHER基因列表分析工具进行了基因本体论（GO）搜索，以寻找相关的免疫途径。值得注意的是，γδT细胞活化是所有免疫相关过程中最富集的途径，其次是自然杀伤（NK）细胞介导的免疫，涉及针对癌症先天免疫应答的两种关键免疫细胞类型（图1h）。图1 地西他滨上调与γδT细胞活化有关的表面免疫分子
a.基于细胞培养（SILAC）的定量蛋白质组学在对照模拟处理与地西他滨（DAC）处理的肺癌细胞中生物素化表面蛋白上的氨基酸稳定同位素标记的实验图。SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，LC-MS / MS液相色谱-串联质谱。b. DAC的治疗方案为每天100 nM，持续72h（D3），然后停药3天（D3R3）。c. Venn图显示了在A549细胞中D3和D3R3处识别的表面蛋白的数量。d.地西他滨处理后A549细胞中D3和D3R3上调的蛋白质的散点图。e. 热图显示了D3和D3R3处DAC处理与模拟处理的A549细胞中免疫相关表面分子的log2倍变化。f.  Venn图显示了在A549，H1299和CL1-0细胞中通常在D3R3处识别的表面蛋白的数量。g. 柱状图，显示了在D3R3进行地西他滨处理后，与模拟处理的细胞相比，与A549，H1299和CL1-0细胞的表面蛋白质组中与先天免疫有关的所选表面蛋白质的相对蛋白质丰度。对于单个细胞系的每次处理，n= 1。h. PANTHER基因清单分析了D3R3上地西他滨上调的蛋白的免疫相关途径。 2.具有抗肿瘤功能的人Vδ1γδT细胞的离体扩增
基于DAC介导的表面组数据，我们认为表观遗传疗法有可能增强γδT细胞对肿瘤的攻击。为了对γδT细胞进行功能研究，我们的小组进一步优化了在γδTCR/CD3激动剂抗体存在的情况下的连续细胞因子刺激方案，用于从健康献血者的外周血中体外临床级扩增γδT细胞，优先富集Vδ1+亚群“δ1T”(DOT细胞)，该过程不需要先前报告中显示的初始γδT细胞纯化和αβT细胞耗竭步骤。在21天的过程中，CD3+细胞群中总γδT细胞的百分比从不到10％增加到超过90％，而Vδ1+T细胞约占所有γδT细胞的70％（图2a）。同样，我们观察到Vδ1T细胞扩增了1571–14,245倍（第21天/第0天），但是使用相同的方案，另外5名健康供体中的Vδ2T细胞只有3到59倍。为了评估扩增的γδT细胞的免疫表型，我们在基线和离体扩增后，使用大规模细胞术对PBMC进行了单细胞分析，并设计了可表征T细胞和MHCunrestricted免疫相关受体的抗体。我们使用t分布随机嵌入（t-SNE）来研究离体扩增前后T细胞内的差异和细胞异质性。在扩张14天后，我们从外周血中优先富集了Vδ1+亚群（图2b）。在扩展的Vδ1+子集中，我们观察到不受MHC限制的免疫相关受体（包括NKG2D，CD226，CD244，NTB，CRACC和NKp30）的差异表达，并且这些受体的表达水平高度相关（图2c）。此外，我们离体扩增的γδT细胞表达了细胞溶解脱颗粒的标记物（例如CD107a）以及分泌的抗肿瘤效应细胞因子（即TNF和IFN-γ）。另一方面，扩增的γδT细胞几乎不分泌肿瘤细胞或阴性调节细胞因子，例如IL-17A和IL-10，也不表达PD-1（与疲惫状态相关的免疫检查点）（图2b），这消除了在体外扩增方案中持续刺激细胞因子导致γδT细胞过早耗尽的担忧。研究数据表明，扩增的DOT样细胞（为简单起见，在下文中称为γδT细胞）处于活化和增殖阶段，其抗肿瘤表型具有潜在的肿瘤治疗价值。
3.DNMTi增强γδT细胞介导的肺癌细胞的细胞溶解
随后，我们研究了用低剂量DAC预处理是否可以增强肺癌细胞对γδT细胞攻击的敏感性。首先，我们发现未处理的肺癌细胞与γδT细胞在效应子与靶标（E：T）之比为3：1的条件下进行体外共培养，仅会引起A549人肺癌细胞20-30％的细胞溶解；另外，每天用100nM DAC对人类肺癌细胞（即HCC827，H1299和A549细胞）进行72小时的治疗，可显着增强以相同E：T比率时，γδT细胞对肺癌细胞的杀伤作用。另一方面，我们使用膜联蛋白V和碘化丙啶的凋亡测定法，发现单独使用任何一种疗法均可导致最小或中等程度的细胞死亡（图2d，e）。我们在其他几种肺癌细胞系中观察到了类似的增强作用，包括H2981、PC9、PC9-IR、H157、CL1-0和CL1-5，以及来自患者恶性胸膜的肺癌细胞积液PDC0899（图2f）。我们还使用细胞基质阻抗感应（ECIS）系统跟踪了DAC对γδT细胞杀伤的增强作用，该系统是一种实时监测γδT细胞杀伤过程的生物物理方法。γδT细胞介导的细胞溶解通常在30分钟至几小时内发生，通过以不引起明显细胞毒性的剂量进行DAC预处理，可以增强细胞溶解效果，值得注意的是，这种增强作用可以在其他肿瘤类型中观察到，例如HCT116结肠癌细胞。此外，我们观察到在联合使用DAC和离体扩增的γδT细胞联合治疗后，来自健康供体的PBMC的细胞毒性没有显着增加，这表明这种增强作用可能对正常细胞无作用。除了通过直接接触的依赖颗粒胞吐作用的细胞毒性途径外，活化的γδT细胞还可以通过分泌与TRAIL受体结合的TRAIL和下游的凋亡途径，实现非接触细胞毒性引发癌症死亡。为了评估分泌的TRAIL介导的细胞凋亡在DAC增强作用中的重要性，我们使用了Transwell系统，该系统允许γδT细胞分泌的TRAIL扩散到癌细胞而无需直接细胞接触。研究显示24小时后未观察到明显的癌细胞死亡，暗示DAC增强的γδT细胞杀伤需要直接的细胞接触。此外，我们使用允许γδT细胞通过膜的Transwell共培养系统评估了DAC是否增强γδT细胞的趋化性。数据表明，DAC的增强作用不依赖于增强DAC引发的癌细胞对γδT细胞的化学吸引作用（图2g）。图2 地西他滨增强γδT细胞介导的肺癌细胞的细胞溶解
a. 柱状图显示了健康供体外周血扩增后，来自健康供体外周血的CD3+群体中γδT细胞亚群的百分比。数据表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。b. 在基线和离体扩增后通过PBMC分析PBMCCD3 + T细胞tSNE图的叠加。每个点代表一个单元格。颜色代表指示标记的表达水平。红色为高，蓝色为低。c. 通过质谱分析在离体扩增的γδT细胞中表达的标记物的Pearson相关性。d. 用单独的100nM地西他滨（DAC），单独的γδT细胞或DAC/γδT细胞组合治疗后，人肺癌细胞系中膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）凋亡测定的代表性流式细胞术分析。效应子与目标的比率（E：T）为3：1。e.点图显示了d中描述的凋亡测定法的三个生物学重复（平均值±SEM）。f. 从恶性胸腔积液患者衍生的肺癌细胞系PD0899的膜联蛋白V和碘化丙啶凋亡测定（平均值±SEM，n= 3，独立实验）。g. γδT细胞（上部腔室）向模拟或DAC处理的肺癌细胞（下部腔室）的Transwell迁移分析。每个高功率场计算下腔室中γδT细胞的数量。显示了下部小室中γδT细胞（Hoechst33342标记；绿色）和肺癌细胞（钙化蛋白保留；红色）的代表性图像。数据表示为平均值±标准差（SD）。比例尺：100μm。p值是通过单向方差分析采用Tukey的多重比较测试（面板a，e和f）或双面Mann-Whitney检验（g）来计算的。
4. DNMTi促进癌症和γδT细胞之间的突触形成
由于免疫细胞对癌细胞的有效裂解依赖于功能性免疫突触，促进溶胞颗粒的定向和协调传递，因此，我们通过磷酸酪氨酸(pTyr)的免疫荧光染色来研究γδT细胞和经DAC预处理的癌细胞之间免疫突触形成的效率，pTyr是具有活性信号的免疫突触的标志。我们观察到，γδT和DAC处理的H1299肺癌细胞之间形成的免疫突触数量要比模拟处理的细胞高得多（图3a）。为了寻找参与突触相互作用的关键分子，我们比较了DAC诱导的两种人肺癌细胞系H1299和A549的表面蛋白质组，这两种细胞在DAC处理后均显示出增强的γδT细胞杀伤力。在鉴定出的蛋白质中，两种细胞系中的细胞间粘附分子1（ICAM-1）高度上调（图3b）。Western印迹证实，DAC可以在许多肺癌细胞系中显着上调ICAM-1蛋白（图3c），包括恶性胸腔积液PDC062的肺癌细胞系。ICAM-1是一种表面糖蛋白，是免疫球蛋白超家族的成员，作为一般的粘附分子存在于免疫细胞、内皮细胞和上皮细胞中。我们的研究证明ICAM-1与其他经典的免疫突触蛋白（包括LFA-1和用于激活T细胞的接头）一起位于癌症-γδT免疫突触中（图3d）。有趣的是，在肺癌细胞（即A549，H1299和CL1-0）中使用CRISPR技术（补充图6a，b）敲除ICAM1（KO-ICAM1），减弱了DAC对γδT细胞杀伤的增强作用（图3e，f）。另一方面，用Tet-On系统在肺癌细胞系中过表达ICAM1（OV-ICAM1）明显增强了γδT细胞介导的对人肺癌细胞的细胞毒性（图3g，h）。如预期的那样，DAC对ICAM1基因敲除细胞的治疗未能增强肺癌和γδT细胞之间的免疫突触形成（图3i）。总体而言，数据表明，ICAM-1介导的突触结构的粘附和稳定对于DAC对γδT细胞抗肿瘤免疫的增强作用至关重要。图3 地西他滨促进肺癌与γδT细胞之间的免疫突触形成
a.通过磷酸酪氨酸（pTyr）染色对H1299肺癌和γδT细胞之间的免疫突触进行免疫荧光成像，显示了每种治疗方法在八个随机采集的高倍视野上每个癌细胞的免疫突触的定量（点±SD）。比例尺：100μm。b.地西他滨（DAC）诱导的H1299和A549细胞中D3R3的表面蛋白质组的散点图。c.具有代表性的蛋白质印迹分析在模拟和DAC处理的人肺癌细胞中对ICAM-1的表达。d. 在γδT与DAC处理的H1299肺癌细胞之间的免疫突触处，ICAM-1的免疫荧光染色。比例尺：10μm。e.用CRISPR敲除ICAM1（KO-ICAM1）对H1299肺癌细胞进行凋亡分析，检测γδT细胞杀死2h。模拟DAC、γδT细胞或DAC和γδT细胞的组合治疗肺癌细胞。f.条形图显示了受到γδT细胞杀伤2h的三种人类肺癌细胞系（KO-ICAM1）的细胞死亡。数据总结自每种细胞系的两个独立过表达克隆(平均扫描电镜)。g.用Tet对ICAM1（OV-ICAM1）表达系统进行Tet杀伤2h的H1299肺癌细胞的凋亡分析。h.柱状图显示了ICAM1过表达的人肺癌细胞系受到γδT细胞杀伤2小时后的细胞死亡。从每个细胞系的两个独立的过表达克隆中总结数据（平均值±SEM）。i. H1299、KO-ICAM1细胞和γδT细胞之间的免疫突触的免疫荧光成像。比例尺：100μm，点图显示了每种治疗方法在六个随机获取的高倍视野上每个癌细胞的免疫突触的定量（点数±SD）。p值通过双面Mann-Whitney试验计算（a，i）或单向ANOVA检验（f，h）计算的。
尽管Vδ1细胞是离体扩增γδT细胞中的主要细胞亚群，但细胞制备物中可能含有Vδ2细胞和CD8T细胞的次要亚群（图2a）。为了进一步剖析每个细胞亚群对免疫突触形成和肿瘤溶解活性的潜在贡献，我们通过荧光激活细胞分选术（FACS）分离了单个细胞亚群（即Vδ1，Vδ2和CD8T细胞）以进行共培养实验H1299肺癌细胞。值得注意的是，与Vδ2或CD8T细胞相比，Vδ1细胞表达更高水平的CD107a，并表现出更强的溶细胞能力。我们还观察到癌细胞和Vδ1细胞之间形成的免疫突触数量比Vδ2或CD8T细胞更大。数据表明，Vδ1细胞可能是γδT细胞介导的抗肿瘤反应的主要参与者，因为它们在细胞数量和功能能力方面均占主导地位。值得注意的是，在非Vδ1细胞（例如Vδ2细胞）上γδTCR的假定配体并未在蛋白质组学中进行研究，BTNL337也不是Vγ4Vδ1TCR的配体。因此，在这种情况下，这些配体对于γδT细胞的细胞溶解活性可能不是必需的。值得注意的是，阻断NKG2D减毒γδT介导的DAC预处理肺癌细胞可产生细胞溶解作用，这表明NKG2D受体-配体轴对γδT细胞的免疫识别也很重要，而DNMTi诱导的ICAM-1进一步增强了肿瘤细胞的溶解。 5.DNMTi通过重新排列细胞骨架来稳定突触裂
当我们进一步破译DAC如何影响突触结构以发挥不受MHC限制的细胞毒性作用时，我们在免疫突触区域附近的癌细胞膜上观察到丝状肌动蛋白（F-actin）的显着积累（图4a，b）。当我们敲除H1299肺癌细胞中的ICAM1时，在免疫突触中DAC诱导的F-肌动蛋白蓄积显着减少（图4c），这与突触裂隙宽度的显着减少有关（图4d）。相比之下，经过DAC处理的，具有ICAM-1正常表达的肺癌细胞建立了免疫突触，并在癌症和γδT细胞之间形成了突触性裂隙（图4d）。值得注意的是，用细胞松弛素B对肌动蛋白聚合的药理学破坏消除了免疫突触处由多巴胺诱导的F-肌动蛋白聚集和pTyr信号，但对ICAM-1表达的影响似乎很小（图4e）。此外，细胞松弛素B还减少了DAC对突触裂隙宽度的影响。此外，细胞松弛素B可以显着抵消DAC对免疫突触形成的增强作用（图4f，g）。由于F-肌动蛋白的积累和较大尺寸的突触裂隙是激活而不是抑制性免疫突触的特征，我们的数据表明，数模转换器重塑肌动蛋白细胞骨架，以促进癌症和γδT细胞之间活化免疫突触的形成。图4 地西他滨通过增强肌动蛋白的细胞骨架来稳定免疫突触间隙
a.在D3R3的γδT细胞和DAC预处理的H1299肺癌细胞之间的免疫突触处，对F-肌动蛋白（红色），ICAM-1（绿色），pTyr（磷酸酪氨酸，白色）进行了免疫荧光染色。比例尺：10μm。进行了三个独立的实验。b. γδT细胞和H1299肺癌细胞之间的界面的免疫荧光图像（亲代或KO-ICAM1）。H1299癌细胞外围的F-肌动蛋白（红色）信号在下部面板的二维半（2.5D）图像中显示。比例尺：10μm。进行了三个独立的实验。c.来自三个独立实验的γδT细胞与H1299肺癌细胞（亲代或KO-ICAM1）之间的五个pTry阳性免疫突触的F-肌动蛋白和ICAM-1信号强度的点图（均值±SD）。d.对ICAM-1、F-肌动蛋白、pTyr染色的γδT细胞（标记为T）和H1299肺癌细胞（标记为C）之间的免疫突触的免疫荧光图像。进行了三个独立的实验。e. γδT细胞和H1299细胞之间的免疫突触处F-肌动蛋白信号强度的点图。将H1299细胞用PBS（模拟）、单独的DAC或DAC预处理（D3R3）和1μg/mL Cyto B（细胞松弛素B）的组合预处理1.5h，然后再与γδT细胞共培养（均值±SD），在三个独立的实验中，n= 13–20个免疫突触。 f.用PBS（模拟）、单独使用DAC以及DAC和CytoB组合预处理的γδT和H1299细胞之间的免疫突触的免疫荧光图像。下图显示了每种处理的正方形区域的放大图像。箭头表示γδT和H1299细胞之间的免疫突触。比例尺：100μm（上部）和20μm（下部面板）。进行了两个独立的实验。g.点图显示了用PBS（模拟）、DAC以及DAC和CytoB组合预处理的H1299细胞在八个随机抽取的高倍视野上每个癌细胞的免疫突触数量（平均值±SD）。p值是由两向方差分析（c）或单向方差分析与Tukey的多重比较检验（e，g）计算得出的。 6. DNMT的耗尽会诱导γδT敏感的细胞骨架基因模式
免疫细胞中适当的细胞骨架动力学和排列对于好的免疫反应结果至关重要。然而，研究者仍未完全了解免疫突触癌细胞侧的细胞骨架表达模式，其调控以及相关的功能后果。根据我们对DAC诱导的肌动蛋白细胞骨架重组的观察（图4），我们推测DNMT的破坏可能对免疫相关的细胞骨架基因网络起作用。实际上，DAC处理后的五种肺癌细胞系（即A549、CL1-0、CL1-5、PC9和H1299）的全基因组mRNA序列数据显示出与细胞骨架动力学和重组有关的基因/酶的显着诱导，包括CORO1A、HCLS1、FES等（图5a）。基因集富集分析（GSEA）还揭示了与肌动蛋白细胞骨架重组以及基于中间丝的过程有关的基因集的富集，相反，与微管相关的基因组似乎被下调（图5b，c）。同样，DNMT的遗传耗竭可概括相似的细胞骨架基因表达谱，因为我们分析了将DNMTs靶向shRNA的结肠癌细胞系（例如HCT116和DLD1）的转录组数据（图5d）。因此，数据表明特定的细胞骨架重塑模式是DNMT依赖性的。此外，DAC处理后这些细胞骨架基因的表观遗传调控似乎是一个高度协调的过程。当我们使用InfiniumMethylationEPIC Bead Chips检查人肺癌细胞中三个细胞骨架基因模块（肌动蛋白细胞骨架、中间丝和微管）中基因的启动子DNA甲基化状态时，我们发现肌动蛋白基因模块中的基因在基线时具有较高的启动子DNA甲基化水平，并在DAC处理后去甲基化。相反，微管模块中的基因倾向于具有较低的基线甲基化水平，这被DAC改变得很少（图5e）。我们进行了Omni-ATACeq研究染色质可及性如何参与细胞骨架模块的转录调控。通常，在基线时具有高启动子DNA甲基化水平的基因往往具有难以接近的染色质，在DAC处理后，它们获得了适度但至关重要的表达性。有趣的是，由DAC上调的具有低基础启动子DNA甲基化的基因在TSS处预先存在可识别的染色质，在DAC处理后仍可识别。当我们仔细检查细胞骨架相关基因的染色质模式时，我们观察到肌动蛋白或中间丝相关过程中基因启动子的染色质有中等程度的变化（图5f）。相反，在由DAC下调的微管相关基因上，启动子染色质的可及性显着降低（图5f）。协调的调节模式可以通过每个细胞骨架模块EVPLL，TUBE1和DAPK3中的单个基因来举例说明。图5 DNMT的耗尽诱导癌细胞中的γδT敏感细胞骨架基因表达
a.火山图显示了在DAC处理的人类肺癌细胞与模拟治疗的人类肺癌细胞（即A549、CL1-0、CL1-5、PC9和H1299）中差异表达的基因。y轴表示统计显着性（p值的-log10），x轴显示DAC处理组和Mock处理组之间的log2倍变化值。与肌动蛋白细胞骨架、中间细丝、微管有关的基因分别用红色、蓝色和绿色标记。b.在五种经DAC处理的肺癌细胞系A549、CL1-0、CL1-5、PC9和H1299中，mRNA-seq数据的基因集富集分析显示了与肌动蛋白细胞骨架重组，基于中间丝的过程以及与微管相关的基因模块有关的基因集。c.热图显示了通过mRNA-seq测量的DAC处理和模拟处理的人肺癌细胞中肌动蛋白-细胞骨架、中间丝和微管相关过程的核心富集基因mRNA表达。d.接受shRNA敲低DNA甲基转移酶1（DNMT1）的HCT116和DLD1人结肠直肠癌细胞系中mRNA-seq数据的基因集富集分析显示了与肌动蛋白细胞骨架重组、基于中间丝的过程以及与微管相关的基因模块有关的基因集。e.箱形图显示了用100nM DAC处理3天，然后进行3天无毒培养（D3R3）的人肺癌细胞中肌动蛋白细胞骨架、中间丝和微管相关基因模块中基因的启动子甲基化状态。甲基化数据通过Infinium甲基化EPIC阵列进行分析。f.肌动蛋白细胞骨架重组、基于中间细丝的过程以及DAC处理的肺癌细胞与模拟治疗的肺癌细胞系中微管相关模块中转录起始位点的免疫荧光染色。
7.TP53是突触细胞骨架和表观遗传蛋白的集线器
为进一步阐明表观遗传蛋白与免疫突触细胞骨架之间的关系，我们通过“机能途径分析”（IPA）对肺癌细胞系中的DAC转录组进行了基因网络分析，结果揭示了免疫突触分子、细胞骨架、和表观遗传蛋白之间的联系。如该网络所示，我们发现与微管组织有关的基因（即TUBG1、DCTN1和PLK1）普遍下调，相反，参与肌动蛋白和中间丝动态的基因（即CORO1A、GFAP和DES）被上调。ICAM1将表面免疫受体/HLA分子连接至细胞质中的细胞骨架，该骨架与TP53和细胞核中的其他表观遗传修饰剂（即DNMT、HDAC和SMARCA4）相连。进一步的上游调节剂分析表明，T细胞效应细胞因子（例如IFNG和TNF）可能会增强DAC诱导的免疫表面分子（包括ICAM1、ICOLSG和HLA）的表达模式。此外，TP53似乎是一个枢纽基因，介导免疫表面分子和细胞骨架响应表观遗传修饰而发生协调变化，这意味着功能性TP53网络对于DAC产生有效的免疫增强作用必不可少。
8. DNMTi调节功能性γδT细胞子集
为了评估DAC如何影响γδT细胞的机制，我们使用了流式细胞仪来分析经过或未经过DAC处理的扩增γδT细胞表型和功能性免疫参数，两组细胞的数据通过x移位算法聚集在一起，并计算了未经处理和经过DAC处理的扩增γδT细胞中每个亚群的频率，表明CD3+ T细胞内的十四个簇（称为T1至T14，按未处理组与DAC处理组之间的频率差排序），每个簇均具有明显的表型和功能性效应子特征。重要的是，通过DAC处理诱导的前两个细胞簇对应于Vδ1，并表达更高水平的CD226、CD244、CD2和CRACC，以及更强的功能性效应物，包括CD107A、TNF、颗粒酶B、IL-2和IFN-γ；DAC处理后，细胞频率下降了。Vδ1T细胞从另外五个用10nM DAC治疗的健康个体中扩增的实验，验证了这一结果。我们观察到了抗肿瘤效应细胞因子（如IFN-γ和TNF）产量增加的趋势。此外，经过DAC处理后，在五个个体（供体＃1，＃3和＃5）中的三个个体中，共表达两种或多种效应细胞因子的多功能Vδ1+细胞的百分比显着增加。由于多功能T细胞通常被认为是保护性免疫的标志，因此DAC增加γδT细胞多功能性的数据进一步加强了使用DAC联合治疗和γδT细胞过继转移的理论基础。
9. DNMTi和γδT细胞的联合治疗可延长小鼠的生存期
随后，我们研究了免疫受损的NSG小鼠体内离体扩增的人γδT细胞（静脉注射）过继转移后与DAC（腹膜内注射）联合治疗的体内效应，鼠携带H1299人肺癌异种移植物（图6a）。与接受生理盐水或单独接受任一治疗的小鼠相比，联合治疗组的小鼠肿瘤更小，总生存期明显更好（图6a，b）。病理上，组合组的肿瘤组织不仅较小，而且显示出松散的结构和明显的纤维化，相反，对照组中的肿瘤组织似乎是肿瘤细胞较多，并具有出血和坏死的区域（图6c）。值得注意的是，在静脉注射γδT细胞后几小时，在携带肺癌异种移植物的NSG小鼠的数模转换器治疗组中，γδT细胞的体内成像显示出增强的归巢能力和显著的肿瘤内γδT细胞浸润，而在对照组中，我们观察到γδT细胞的较差的肿瘤内浸润（图6d）。这些数据证明了将DAC与γδT细胞的过继转移结合起来在体内治疗肺癌中的策略的有效性。图6 地西他滨联合γδT细胞的过继转移延长了肺癌异种移植小鼠的存活期
a.对荷人肺癌H1299的NOD-scidIL2 GNull(NSG)小鼠进行体内实验，所述小鼠经DAC、过继人γδT转移或两者治疗。对于每个药物治疗周期，连续三天腹膜内给药，然后在第5天和第12天静脉注射体外扩增的γδT细胞。在第三个治疗周期后，注射γδT细胞一天后处死小鼠。肿瘤被手术切除，并测量重量。统计结果用图基多重比较试验的单因素方差分析确定。n=来自两个独立实验的9只小鼠(平均扫描电镜)，皮下注射。b.显示了每个治疗组中NSG小鼠的Kaplan–Meier生存曲线。p值通过MantelCox测试（单面）计算。c.每个治疗组中代表性小鼠肿瘤的苏木精和曙红（H＆E）染色。整个肿瘤的图像由数字幻灯片扫描仪生成。d.肺癌异种移植小鼠模型γδT细胞转运的体内成像。体外扩增的γδT细胞预先用类细胞红长期细胞示踪染料染色。携带H1299肺癌异种移植物的NSG小鼠连续三天(第1-3天)用DAC(0.2毫克/千克体重)或生理盐水腹膜内治疗，随后在第5天和第12天尾静脉注射预先处理的γδT细胞。在第12天γδT注射后2小时和4小时使用IVIS光谱(Ex570，Em640)拍摄图像。实验重复进行。这里展示了一些有代表性的图像。BF亮场，白圈肿瘤区。
10. 细胞骨架基因模型预测肺癌患者的生存
在临床试验设计中，正确选择临床患者对于治疗成功至关重要。为了研究DAC诱导的细胞骨架特征是否可能对患者的一般免疫反应性和/或表观遗传启动的γδT细胞疗法的益处进行分层，我们检查了台湾大学附属医院和原发性肺癌组织的RNA-seq数据（TCGA）。基于肌动蛋白、中间丝和微管相关基因模块的核心富集基因，原发性肺腺癌组织聚集（图5c）显示了三类：敏感免疫，中间程度免疫和不敏感免疫；我们在敏感免疫和中间程度免疫组的肿瘤组织中也检测到了较高的γδTCR基因表达。为了进一步探讨细胞骨架特征与免疫反应性之间的关系，我们使用CIBERSORT-LM7参考基因特征矩阵对来自TCGA肺癌组织的转录组数据进行了计算反卷积，该矩阵由改进的CIBERSORT算法生成。我们发现，除了γδT细胞外，其他免疫细胞类型（包括CD4和CD8T细胞、B细胞、粒细胞、单核细胞和NK细胞）的基因信号性质也比γδT细胞丰富。值得注意的是，我们观察到了具有免疫敏感性特征的患者的最佳总体存活率，这与在肺癌细胞系中鉴定出的DAC诱导的免疫反应模式相对应（肌动蛋白和中间细丝模块被上调，而微管模块被下调（图7b），相反，在NTUH和TCGA队列中，免疫细胞不敏感的信号均与最差的预后相关（图7b）。研究数据突显了细胞骨架的表观遗传重组作为患者预后的临床指标的重要性，并可用于患者选择，说明了γδT细胞治疗对肺癌患者的益处。图7 通过免疫细胞骨架基因模型对肺癌患者进行分层
a.免疫细胞骨架基因模型的热图，来自台湾大学医院（NTUH，上）和癌症基因组图谱（TCGA，下）的原发性肺腺癌肿瘤组织的mRNA-seq数据。b. NTUH（上）和TCGA（下）肺腺癌患者队列的总体生存分析，这些队列按与不同γδT敏感性相关的免疫细胞骨架基因特征分层。p值通过Mantel-Cox检验（单面）计算。

讨论

DNA甲基转移酶抑制剂除具有抗肿瘤作用外，还可以用作多种免疫调节剂，DNA甲基转移酶抑制剂不仅可以增强癌细胞的免疫原性，而且还可以调节αβT细胞的命运决定，包括分化和衰竭。尽管提出了脱氧核糖核酸转移酶对检查点抑制剂8的增强作用，但对具有高突变负荷的肿瘤触发常规αβTCR驱动的、MHC限制的免疫反应的要求限制了这种方法的额外治疗益处。使用定量表面蛋白质组学方法与表观基因组/转录组学分析相结合，我们发现了DNMTis的免疫调节作用，可通过上调粘附分子和重组免疫突触细胞骨架网络来增强不受MHC限制的γδT细胞的基因治疗，从而促进肿瘤细胞溶解。γδT细胞是T细胞的一个独特子集，连接了适应性特征和快速的先天性反应。我们基于TCRγ和δ链的重组，定义了人类γδT细胞的两个主要子集Vδ1+和Vδ2+。Vδ1+ T细胞主要位于周围组织中，具有强大的抗癌能力，而无需像Vδ2+T细胞那样调节抗体。尽管如此，由于缺乏可靠的扩增方案，Vδ1+T细胞的临床应用受到了限制。取而代之的是，Vδ2+T细胞可以很容易地用氨基双膦酸酯（例如唑来膦酸）或磷酸抗原扩增。但在大多数临床试验中，我们使用Vδ2+T细胞对实体瘤的临床疗效有限。此外，某些γδT亚群可能具有原生功能；因此，在用于治疗的细胞扩增过程中应小心谨慎。鉴于DOT细胞研究的最新进展，我们修改后的扩展功能消除了对αβT耗竭的需求，并通过具有抗肿瘤免疫力的Vδ1+T细胞来代替已被证明可促进肿瘤生长的产生IL-17的γδT亚型肿瘤进展。这种针对Vδ1+细胞的临床级扩展方案可能有助于改进当前的γδT细胞疗法，以及开发对两种应激都有作用的双功能嵌合抗原受体工程化的人γδT细胞（CAR-γδT细胞）。我们的研究表明DNMTis可能会重塑癌细胞的免疫细胞骨架或上调ICAM-1等粘附分子，这些结构成分在正常生理中具有重要作用，并且也存在于正常细胞中。然而，我们在体外或体内均未观察到明显的毒性或正常组织损伤。DNMTi的增强作用可能建立在γδT细胞现有的肿瘤识别能力上，初次接触后，该药物可增强γδT与癌细胞之间的相互作用。事实上，我们证明了NKG2D的阻滞减弱了DAC预处理的H1299肺癌细胞γδT介导的细胞溶解，这表明γδT细胞的常规肿瘤识别机制（例如NKG2D/ NKG2DL相互作用）部分有助于杀死γδT。另一方面，NKG2DL在癌细胞上的表观遗传上调可能不是DNMTi增强作用的唯一决定因素。正如我们在不同肺癌细胞系中的蛋白质组学数据所显示的那样，DNMTi诱导的γδTCR或NKG2D配体的上调发生在观察到DNMTis增强作用的部分而非全部细胞系中。此外，每个γδTCR亚型似乎都有其自己的特定目标配体，一种特定的表面配体不太可能解释DNMTis增强γδT介导的杀伤作用。因此，我们通过协调表观遗传过程对DNMTi介导的细胞骨架重组发现为增强基于γδT疗法的有效性提供了机制说明。此外，我们关于免疫突触靶细胞的免疫突触-细胞骨架网络的研究结果具有高度重要的临床意义。基于这种表观遗传的细胞骨架基因特征，我们可以将两个独立患者队列中的原发性人类肺癌组织清晰地分层，这意味着细胞骨架排列是癌细胞的固有特征，并且可用作患者响应细胞的免疫疗法或受益于其他表观遗传重塑的标志物。因此，表观遗传将免疫抵抗的细胞骨架模式转化为免疫敏感的模式的可能性可以提供潜在的治疗策略，以最大化基于细胞的免疫疗法的临床益处。此外，我们通过整体蛋白质组学方法表征了肺癌细胞的表面免疫组蛋白，揭示了先天性和适应性免疫蛋白网络均可被DAC改变，并阐明了该药物的多方面免疫调节潜力。我们还证明，DAC可以增强Vδ1亚型的多功能性以发挥抗肿瘤免疫力。这一发现与以前的报道不同，后者表明DAC可能上调离体扩增的Vδ2T细胞上的抑制性受体KIR2DL2/ 3并抑制其增殖和效应功能，这种差异可能归因于不同的γδT细胞子集、扩增条件或DAC给药时间表。同样，将DNMTi与离体扩增Vδ1细胞联合治疗的安全性和有效性可能取决于进一步的临床研究。尽管我们观察到药物对正常PBMC的毒性很小，但这一发现并没有抵消对其他正常细胞或组织类型的潜在副作用，在设计临床试验时应考虑到这一点。此外，尽管我们证明了DNMTi在免疫受损的小鼠模型中对γδT介导的肿瘤溶解具有增强作用，而对其他免疫细胞类型的干扰很小，但是该模型在概括癌细胞与完整的免疫微环境之间的复杂相互作用方面受到限制。由于ICAM-1是一种粘附分子，可能被其他T细胞亚型（例如αβT细胞）识别，因此类似的ICAM-1依赖性机制可能参与了癌症与αβT之间的相互作用。涉及更多具有溶解细胞功能的T细胞，可能潜在地增强免疫疗法的功效。我们观察到的DAC对CD8T细胞的适度增强作用可能是由于同种反应性识别，有必要进一步研究αβT和其他免疫细胞类型在DNMTi增强的γδT治疗中的作用。总而言之，我们的发现表明，DAC与γδT细胞的过继免疫疗法相结合对肺癌患者的治疗潜力，可用于对检查点抑制剂无反应或缺乏可靶向的突变/特异性癌症抗原的患者。特别是，那些具有低ICAM-1表达肿瘤或不利的细胞骨架基因特征的人可能会受益于表观遗传重编程以增强γδT细胞的治疗效率。这项研究还为药理学调节免疫突触-细胞骨架网络以实现有效的抗肿瘤免疫力提供了分子基础。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33846331/

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