科研 | REDOX BIOL.: Fsip1双等位基因突变损害了小鼠精子顶体囊泡的形成并减弱了鞭毛的发生（国人佳作）

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编译：微科盟禾禾，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

纤维鞘相互作用蛋白1 （Fsip1）是精子鞭毛蛋白质组的一种细胞骨架结构蛋白。已有研究表明它在肿瘤和癌症发生中起着至关重要的作用，然而，Fsip1在精子发生和哺乳动物精子鞭毛发生过程中的作用尚不清楚。Fsip1蛋白在圆形精子细胞中表达量最高，并从细胞核转移到了精子细胞头部的前部。为了研究其作用，作者构建了纯合子无效Fsip1（Fsip1^-/-）小鼠，发现纯合子Fsip1 ^-/-突变小鼠是不育的，精子数量低且运动能力受损。此外，作者在Fsip1 ^-/-突变小鼠的精子中观察到一种与部分圆头精子症表型相似的精子，它们的主要特征为异常头形和鞭毛畸形。在电镜分析中，Fsip1 ^-/-精子显示为线粒体异常积聚，轴丝断裂，细胞质保留。睾丸切片显示Fsip1 ^-/-小鼠的细长精子细胞中细胞质空泡增多，表明鞭毛内运输（IFT）缺陷。最后，作者利用蛋白质组学的方法描述了这种表型微妙变化背后的细胞成分和机制，结果显示，Fsip1 ^-/-突变小鼠下调了顶体膜和囊泡蛋白、鞭毛内运输颗粒B和精子鞭毛成分的形成。研究结果表明，Fsip1是正常精子发生所必需的，并通过减弱鞭毛内转运蛋白在顶体形成和鞭毛发生过程中发挥重要作用。

论文ID

原名：Bi-allelic mutation in Fsip1 impairs acrosome vesicle formation and attenuates flagellogenesis in mice译名：Fsip1双等位基因突变可减少小鼠精子顶体囊泡形成，并减弱鞭毛的发生
期刊：Redox Biology
IF：9.986发表时间：2021.04通讯作者：胡昊，李娜
通讯作者单位：广州医科大学，广州市妇女儿童医疗中心

实验设计

实验结果

1. Fsip1基因突变纯合子小鼠精子异常发生
作者使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建了Fsip1 ^-/-小鼠模型，同时对Fsip1纯合缺失进行了基因分型和确认，使用蛋白质印迹法（图1B）和qPCR（图1C）检查和验证了突变小鼠中Fsip1表达的缺乏。睾丸切片的组织学检查显示，与野生型（WT）小鼠相比，Fsip1 ^-/-小鼠的有丝分裂和减数分裂没有明显异常，然而，在精子形成的最后发育阶段，在圆形精子细胞经过结构调节形成伸长的精子细胞过程中，作者在Fsip1 ^-/-突变小鼠精子中观察到一种产生微妙变化的表型：精子细胞头部伸长的异常形状。这一现象最早出现于精子细胞发生的第9步（图1D），在正常条件下，第9-12步，小鼠的延长精子头部的结构经历了结构修饰，变成了尖端尖的弯刀状；Fsip1 ^-/-小鼠精子头部在这一过渡阶段发生的改变表明Fsip1在减数分裂后精子细胞的发育中起着重要作用。在第10-16步中，与WT小鼠相比，Fsip1 ^-/-表型变化更加明显，精子细胞数减少，剩余精子细胞大多头部形状异常，鞭毛变短或不完全形成。此外，作者观察到Fsip1 ^-/-小鼠的生精上皮中的精子细胞吞噬作用，通过分析附睾切片，进一步追踪完成精子发生过程的精子细胞。研究发现，与WT精子相比，大多数Fsip1 ^-/-精子的形态异常且数量急剧减少（图1E）。为了进一步描述Fsip1 ^-/-表型，作者用电子显微镜分离并观察了附睾尾精子。结果表明，Fsip1 ^-/-小鼠附睾尾精子的形态异常，部分精子头部形态异常，中段缺失，鞭毛短而不完整。此外，通过透射电镜，作者证实了精子鞭毛主要超微结构成分的错配，如线粒体、外层致密纤维和“9+2”轴索结构（图1F）。这些特征表明精子细胞的发育由于精子细胞装配不当而受到损害。基于这一观察，作者认为Fsip1的作用不仅是纤维鞘组装蛋白，还是参与细长精子细胞结构基本组织的必需蛋白。Fsip1 ^-/-精子向前运动百分率显著降低（表1）。与野生型小鼠相比，Fsip1 ^-/-突变体小鼠的大多数精子明显不动。精子向前运动的参数显著降低，包括曲线速度（VCL）、直线速度（VSL）和角速度（VAP）（补充视频）。图1 Fsp1敲除对精子发生的影响
A，示意图显示了用于构建Fsip1敲除（Fsip1 ^-/-）小鼠模型的靶向突变位点；B，蛋白质印迹分析显示在WT和Fsip1 ^-/-小鼠中Fsip1的睾丸蛋白表达水平；C，qPCR结果显示WT和Fsip1 ^-/-小鼠睾丸中Fsip1基因表达水平的点图；D，代表用高碘酸-希夫（PAS）染色的睾丸组织切片亮场图像的轮图，显示Fsip1 ^-/-与WT小鼠在精子发生的12个阶段相比的大体形态和精子发生变化，示意图显示了WT和Fsip1小鼠之间的形态学变化；E，小鼠附睾切片的苏木精-伊红染色；F，附睾尾精子的扫描和透射电镜评估。
表1 使用计算机辅助精液分析仪（CASA系统）评估精子活力Fsip1 ^-/-精子的活力显著降低（每只小鼠分析了5000个精子，每组每种基因型分析了5个精子；数据是平均数±SEM；通过双尾t检验评估显著性）。参考世卫组织标准发布的运动参数。 2. Fsip 1在精子发生过程中的表达和分布
在探讨Fsip1在精子发生和精子形成中的潜在分子功能之前，作者首先研究了Fsip1在曲细精管中的表达和分布。用免疫荧光法检测精子发生不同阶段的Fsip1蛋白表达后，作者发现，Fsip1蛋白在精子发生的所有细胞成分中均有表达。结果显示，Fsip1在精子发生的不同阶段有不同的表达和定位。在圆形精子细胞第9-10步（图2A），Fsip1染色强度最高并定位于细胞核，在第11-12步，荧光从细胞核转移到伸长的精子细胞头部的前部。这些结果表明，Fsip1可能在延长精子细胞的头部形状中起关键作用。图2 Fsip1蛋白在精子发生过程中的表达和定位
A，在第9阶段和第11、12阶段睾丸组织切片中Fsip1（绿色）的表达和定位，顶体蛋白（Acrv1）被用作阶段标记（红色），比例尺=50 μm；B，蛋白质组学数据中代表差异表达的蛋白质火山印迹；C，前20位的细胞组分在log2倍富集时下调。 3. Fsip1缺失对精子发生蛋白质组的影响
作者描述了与Fsip1丢失相关的表型，并探讨了可能的潜在机制，分离睾丸总蛋白并进行基于定量TMT的蛋白质组学研究。与野生型小鼠相比，总共鉴定出109种差异表达蛋白，其中69种下调，40种上调，Fsip1突变小鼠睾丸的变化是野生型小鼠的1.2倍（图2B）。Fsip1小鼠中下调蛋白的细胞成分（图3C）显示顶体膜和囊泡、胞内运输颗粒B、活动纤毛和精子鞭毛成分（精子中段、精子鞭毛、主段）显著减少。总之，Fsip1基因的纯合缺失导致精子形态和发育异常。图3 Fsip1缺失对顶体囊泡蛋白表达和分布的影响
A，基因集富集分析（GSEA）和显示顶体囊泡蛋白差异表达的热图；B，透射电子显微镜显示了拉长的精子细胞头,白色箭头表示精子细胞伸长过程中顶体囊泡和膜的形态变化，比例尺=2 μm；C、D，WT小鼠精子的免疫荧光染色显示了Fsip1和Acrv1的表达和定位，比例尺分别为1 μｍ和5 μｍ；E，WT和Fsip1 ^-/-小鼠精子中Fsip1（绿色）和Acrv1（红色）蛋白的免疫荧光染色；F，蛋白质印迹法评估WT和Fsip 1 ^-/-小鼠睾丸中Acrv1蛋白的表达；G，Fsip1和Acrv1的共免疫沉淀分析，兔IgG作为阴性对照；H，小鼠精子中Fsip1和Acrv1的Duolink原位邻近连接分析，比例尺5 μm。 4. Fsip1的破坏改变了顶体囊泡蛋白的表达和分布
顶体膜通过精子获能和顶体反应在受精过程中起着重要作用。基因组富集分析显示Fsip1敲除导致顶体囊泡相关蛋白的显著下调（图3A），透射电子显微镜证实了精子细胞头部和顶体膜的形态学改变（图3B），顶体囊泡蛋白1 （Acrv1）和Fsip1的免疫共染色显示它们在顶体囊泡中共表达（图3C）。此外，顶体囊泡蛋白Acrv1的荧光信号仅在Fsip1阳性精子中观察到（图3D），Fsip1的丢失导致Acrv1蛋白的移位和扩散（图3E）。作者用蛋白质印迹法（Western Blot）进一步定量Acrv1蛋白的表达水平，发现其在Fsip1小鼠的睾丸中显著降低（图3F）。基于上述发现，作者使用CoO-IP（图3G）和邻近连接试验（PLA）（图3H）进一步检查并证实了Fsip1和Acrv1之间的蛋白质-蛋白质互作，因此作者认为Fsip1可能在顶体囊泡和膜的形成中起重要作用。 5. Fsip1的破坏会损害鞭毛的形成
作者观察到Fsip1的纯合敲除引起了一种细微的表型，使人联想到部分圆头精子症，表现为精子头部和鞭毛超微结构异常。TEM镜检显示Fsip1 ^-/-睾丸轴突极少，线粒体周围有大的空泡。对蛋白质组学数据进行GSEA富集分析，作者发现差异表达的蛋白质与鞭毛中段（MP）和主段（PP）相关（图4A、B），包括运动相关蛋白的显著下调（图4C）。Western Blot检测Odf2、Akap3、Gapdhs和Akap4的蛋白质表达水平（图4D），在Fsip1 ^-/-小鼠中，Odf2、Akap3和Gapdhs显著下调，而Akap4却显著上调。睾丸切片免疫染色显示，Akap4以凝集状态或压缩状态保留在伸长精子细胞的细胞质中，附睾尾精子也观察到同样的情况（图4E）。图4 Fsip1效率对鞭毛形成蛋白的影响
A，GSEA富集分析和热图显示精子中段相关蛋白的表达水平；B，主片段相关蛋白；C，精子运动相关蛋白；D，Odf2、Akap3、Akap4和Gapdhs的蛋白质印迹分析，以β-肌动蛋白作为内部对照，条形图代表三个独立样本的统计分析，通过双尾不成对t检验计算p值；E，Fsip1和WT睾丸切片和附睾精子中Akap4的免疫荧光染色，比例尺分别为50 μｍ和10 μｍ。 6. Fsip1敲除会减弱鞭毛内转运蛋白
在精子形成过程中，鞭毛内蛋白复合物对顶体囊泡发育和鞭毛形成至关重要。与野生型小鼠相比，Fsip1突变体小鼠睾丸切片的透射电镜结果显示轴突结构较少或缺失，并且在伸长的精子细胞中存在带有许多大液泡的细胞质残余物（图5A）。一些伸长的精子细胞被高倍镜下可见的线粒体所包围（图5A右图），表明自噬体是由鞭毛错配造成的。此外，蛋白质组学数据显示Fsip1敲除显著减弱了鞭毛内转运（IFT）蛋白（图5B）。在IFT蛋白中，Ift20的表达下调最为明显。作者用免疫荧光法对Ift20和乙酰微管蛋白进行染色，以检测Ift20在早期精子尾部形成中的共表达情况（图5C）。Western blot结果显示，Ift20在Fsip1 ^-/-小鼠睾丸中的表达显著下调（图5D）；此外，Ift20与Fsip1免疫共沉淀使用（图5E）。这些发现表明Fsip1是表达IFT蛋白所必需的，下调Fsip1 ^-/-中的IFT蛋白可能导致鞭毛发生紊乱。图5 Fsip1敲除在鞭毛形成过程中减弱鞭毛内转运蛋白
A，睾丸切片的透射电镜评估显示，与WT小鼠相比，Fsip1 ^-/-小鼠缺失轴丝结构（左图），Fsip1 ^-/-突变体伸长精子细胞的细胞质残基中有大液泡和线粒体；B，GSEA富集分析和相关热图显示鞭毛内转运相关蛋白；C，睾丸切片中Ift20（绿色）和乙酰微管蛋白（红色）的免疫荧光染色，比例尺分别为2μｍ和10μｍ；D，Ift20的蛋白质印迹分析，β-肌动蛋白作为内参对照，条形图代表三个独立样本的统计分析，p值使用双尾不成对t检验计算；E，蛋白质印迹分析显示Fsip1的免疫沉淀，并与Ift20共沉淀（Co-IP），免疫球蛋白作为免疫印迹阴性对照，β-肌动蛋白用作Co-IP阴性对照；F，示意图显示了与野生型小鼠相比，Fsip1鞭毛内转运蛋白减少导致的精子成分改变。 7. Fsip1与Ift20的相互作用涉及两个特征模体
为了绘制Ift20在Fsip1上的结合位点，作者研究了Fsip1的序列和结构特征。首先，利用蛋白质结构域预测工具对Fsip1的潜在功能结构域进行了鉴定。早期只鉴定出一个Fsip1结构域（Asp4-Glu405，图6A），而Fsip1的其他部分仍然未知。鉴于此，作者利用MEME在线工具对Fsip1的保守基序进行了探索。调查了8个物种，分别为人、小鼠、鸡、中华鳖、Salmo salar, Acanthaster planci, Mizuhopecten yessoensis和Stylophora pistillata。尽管两两相似性较低（除人和小鼠外，相似性均≤60%，图6B），作者依旧鉴定出8个模体，其中第1个模体（Glu264-Asp300）、第2个模体（Gly310-Thr348）和第5个模体（Thr374-Leu403）在所有物种中均有保守性（图6C）。值得注意的是，第4个C端模体（Asp491-Gln579）仅在智人、小鼠、鸡和中华鳖中被鉴定，第三个氮末端基序（残基Met3-Gly41）更保守，出现在Acanthaster planci和更高等的生命形式中。同时，作者通过同源性建模构建了Fsip1和Ift20的结构模型。Fsip1的整体结构采用了扭曲的“W”型整体支架，包括α螺旋和随机线圈（图6D）。Ift20的结构采用了一种延伸螺旋的整体支架，包括α螺旋和随机线圈（图6E）。在结构模型的基础上，作者采用蛋白质-蛋白质柔性对接技术来评估Fsip1和Ift20之间的分子间相互作用。Fsip1上的三个区域（螺旋:met1-Ser20；螺旋:Ser249-phe255；环:Ser279-Val284）被预测与Ift20（螺旋:ile 5-Glu 25；螺旋:Lys43-Gly53；环:Leu57-Lys63）通过分子间氢键和疏水相互作用（图6F）。作者发现，Fsip1上三个预测区域中的两个（螺旋:Met1-Ser20和环:Ser279-Val284）与保守基序第三基序Met3-Gly41和第一基序Glu264-Asp300重叠。图6 Fsip1通过两个蛋白基序与Ift20相互作用
A，Fsip1的域；B，8个物种间Fsip1蛋白的序列相似性；C，在小鼠Fsip1和其他7种动物中发现的模体；D、E，Fsip1和Ift20的三维结构模型的带状图，根据它们的二级结构着色；F，Fsip1/Ift20综合体的结构模型，Fsip1上的三个区域（品红色螺旋:met1-Ser20；螺旋:Ser249-phe255；环:Ser279- Val284）和Ift20上相应的结合位点（石灰色螺旋:ile5-Glu25；螺旋:Lys43-Gly53；环:Leu57-Lys63）叠加新的有色图层突出显示，并由特写视图指示。Fsip1和Ift20的其他部分分别以透明的橙色和冰蓝色的叠加图案显示。

讨论

精子形态在男性生育中起着至关重要的作用。精子形态缺陷涉及多种表型，研究表明，Fsip1 ^-/-小鼠引发了以精子形成受损为特征的部分圆头精子症表型。Fsip1 ^-/-小鼠精子显示异常形态，包括头部畸形、鞭毛装配失败和顶体泡破裂。据报道，有几个基因与精子发育缺陷有关，例如，Tektin4敲除小鼠精子中超微结构发生解体，在Odf2空白小鼠中观察到精子轴丝缺陷，小鼠Akap4、Fsip2和Cabyr缺乏导致纤维鞘缺乏，Ropn1的消融损害了精子主要部分的结构。到目前为止，很少有基因缺陷被确定为人类圆头精子症的直接原因，包括DPY19L2、SPACA1、DNAH17、SPATA16、PICK1、CCIN、C7orf61、ZPBP、CCDC62和C2CD6。然而，由于缺乏体外模型，圆头精子症的分子机制在很大程度上仍然未知。本研究首次证明了Fsip1基因敲除对精子发生的潜在影响，并表明Fsip1不仅是纤维鞘细胞骨架蛋白，而且是参与细长精子细胞基本结构组织的必需蛋白。SEM结果显示，Fsip1 ^-/-精子有明显异常，表现为精子细胞头部形态异常，中段和主段畸形或缺失。TEM结果显示，精子鞭毛的主要超微结构成分，如线粒体、外层致密纤维和“9+2”轴索结构发生了错配，表明精子细胞的发育因精子细胞成分的错配而受损。在Fsip1 ^-/-精子中观察到低的运动性，可能是由于鞭毛的异常形态和结构。本研究结果表明，Fsip1的破坏显著下调了参与顶体囊泡形成的大多数蛋白质。对显著下调蛋白质的细胞成分的富集分析表明顶体膜和顶体囊泡显著减少。本项研究结果中，最近被确定为圆头精子症病因的基因如ZBPB、SPACA1、PICK1和DPYL19L2显著下调。众所周知，DPYL19L2基因的缺失是圆头精子症最常见的原因，患者的患病率约为70%。DPYL19L2作为细胞核和顶体之间的桥梁调节核膜与顶体的粘附。DPYL19L2缺乏导致顶体缺失，是由于核-顶体连接的破坏。此外，PICK1促进了从高尔基体到顶体的运输小泡的形成。Zpbp1缺失导致顶体严重解体。然而，在作者的数据中，SPACA1和SPINK2的截短突变导致人类和小鼠的严重鞭毛畸形也下调了。此外，作者发现Fsip1与Acrv1发生物理相互作用，Acrv1是一种顶体囊泡蛋白，属于骨形态发生蛋白（BMP）I型受体的蛋白质家族。骨形态发生蛋白的受体横跨细胞膜，一端从细胞外表面伸出，另一端保留在细胞内。Acrv1也被认为是生精小管阶段的标志。由于Fsip1的缺失损害了顶体囊泡的定位和头部形状，并与顶体囊泡生物发生蛋白的下调有关，在步骤9-12之间，Fsip1从细胞核向顶体转移的动力学表明了Fsip1在精子细胞伸长阶段的重要作用。此外，鞭毛蛋白的基因集富集分析表明，中段蛋白和主段蛋白的一些成员表达下调；然而，Fsip1在这些关键蛋白下调中的作用仍有待确定。多项证据表明，这些基因的下调导致精子鞭毛发育缺陷，进而导致形态异常，这与作者的发现一致。然而，精子鞭毛中最丰富的蛋白质Akap4被上调，并保留或积累在细长精子细胞的细胞质中，这可能是由于Akap4在体内未组装，直到它被运输到发育中的尾部结构并整合到纤维鞘中。综上，保留的细胞质成分机械地阻碍精子鞭毛的伸长并影响精子的发育。胞质囊泡、纤维样结构和线粒体数量的增加是鞭毛失效的代表，这种现象在鞭毛内转运蛋白缺失或下调时会发生。在细长精子细胞的发育过程中，鞭毛蛋白通过IFT系统沿着精子尾部顺行和逆行。IFT-B控制从细胞体到远端轴突的顺行运输，而IFT-A控制逆行返回。IFT-B或IFT-A单个成员的丧失通常会导致整个亚复合体的功能障碍和顺行或逆行功能的丧失。值得注意的是，Fsip1的缺失减弱了顺行的IFT-B复合体蛋白的功能。但是由于鞭毛尚未完全形成，所以即使它们在结构和功能上都受到了损害，这个过程中也没有体现。在IFT-B蛋白中，Ift20是最活跃的成员，在早期圆形精母细胞的顶体形成过程中共同定位于高尔基体。Follit等人报道，Ift20敲除阻断了纤毛的组装，而不影响高尔基体结构，与本研究结果相似。Fsip1 ^-/-小鼠睾丸中Ift20的表达水平显著降低。这一发现表明Fsip1不仅是一种结构蛋白，而且是顺行IFT-B复合物的蛋白质传递或鞭毛组装的特异性调节剂。Fsip1是不同物种鞭毛蛋白质组的进化保守成分。虽然Fsip1和Ift20之间的相互作用得到了证实，但作者试图确定Fsip1上Ift20的结合位点进一步促使他们研究Fsip1的序列和结构特征。然而，传统的蛋白质结构域预测工具不能提供足够的信息，因为只有一个FSIP1结构域被鉴定，而其他部分仍然未知。使用模体发现工具，作者在8个物种中鉴定了Fsip1中的8个保守模体。巧合的是，先前的发现预测人类FSIP1上的三个区域（螺旋Ser479-Asn492；环Pro541-Leu549和环Tyr310-Gln316）被预测与ULK1（环Ile22-Ala26；环Ala179-Ser184）通过疏水相互作用。所涉及的区域与人类FSIP1的第4个C末端基序（Gly481-Gln569）和最保守的第2个基序（Gly298-Thr336）重叠。这一结果表明FSIP1的第2和第4基序参与了与ULK1的相互作用。在这里，通过同源性建模和灵活的对接，作者还为Fsip1/Ift20复合物生成了一个结构模型，并从该模型中预测了结合位点。有趣的是，Fsip1基因具有4个结合区，其中2个即螺旋Met1-Ser20和环Ser279-Val284分别与小鼠Fsip1的第三个N末端基序（残基Met3-Gly41）和最保守的第一个基序（Glu264-Asp300）重叠，这表明Fsip1的第一个和第三个基序参与了与Ift20的相互作用。本研究表明，Fsip1对正常精子形成是必需的，并通过减弱鞭毛内转运蛋白在顶体的生物发生和鞭毛形成中起着至关重要的作用。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33901807/

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