科研 | Mol.Cell: DNAJC9的重要功能——将热激蛋白整合到组蛋白分子伴侣网络

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编译：微科盟禾禾，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读
从生物合成到组装成核小体，组蛋白通过一系列的组蛋白分子伴侣传递，屏蔽了组蛋白之间的非特异性相互作用。在伴侣蛋白装配过程中，是否存在保护组蛋白折叠或释放受困中间体的机制尚不清楚。利用结构导向和功能蛋白质组学方法，作者鉴定并表征了DNAJC9的组蛋白伴侣功能，即热激伴侣促进HSP70介导的催化作用，并对DNAJC9的组蛋白伴侣H3-H4与MCM2的复合物结构进行了解析，揭示了这种双组蛋白与热激伴侣是如何结合组蛋白底物的。作者发现，DNAJC9通过其J结构域折叠组蛋白H3-H4底物，在组蛋白供应链上游，复制和转录偶联的核小体组装过程中，与HSP70型酶发生互补作用。DNAJC9因其具有的双重功能，将ATP资源型蛋白折叠整合到组蛋白的供应通路中，通过组蛋白的生命活动解决异常的中间产物。

论文ID

原名：DNAJC9 integrates heat shock molecular chaperones into the histone chaperone network译名：DNAJC9将热激分子伴侣整合到组蛋白分子伴侣网络中
期刊：Molecular Cell
IF：15.584发表时间：2021.04通讯作者：Dinshaw J. Patel，黄鸿达，Anja Groth
通讯作者单位：纪念斯隆·凯特林癌症中心，南方科技大学，哥本哈根大学

实验设计

实验结果

1. 热休克共伴侣DNAJC9作为组蛋白伴侣发挥作用
为了鉴定潜在的未知组蛋白伴侣，作者通过免疫共沉淀实验（图1A - 1C），比较野生型（WT）和组蛋白结合突变体（HBM）在稳定同位素标记的SILAC（stableisotopelabeling with aminoacids incellculture）标签中形成的相互作用组蛋白，研究了组蛋白伴侣MCM2和TONSL之间的组蛋白依赖相互作用。为此，作者选择已描述过的MCM2 Y81A Y90A和TONSL N571A突变体，用来破坏组蛋白结合，通过质谱分析证实MCM2与TONSL （图1C）、MCM2与ASF1以及MCM2与FACT复合物（ SPT16 / SP16H和SSRP1 ）之间的组蛋白-伴侣关系。TONSL还与FACT形成组蛋白共伴侣复合物（图1C），证明了此前报道的相互作用的组蛋白依赖性。MCM3和MCM5与MCM2呈组蛋白依赖性相互作用，表明MCM2的组蛋白结合域（HBD）固定了非染色质结合的MCM2-7六聚体，这些六聚体具有盐活性。此外，作者还鉴定了DNAJC9作为假定的组蛋白分子伴侣同MCM2和TONSL形成的与ASF1A/B和FACT共伴侣相似的作用（图1B和1C）。DNAJC9包含一个J结构域，通过结合和刺激HSP70型酶的ATP水解，起到热休克共伴侣的作用，类似于其他HSP40/DnaJ家族成员。HSP70型酶的催化活性，包括HSP70和HSC70，从此被称为“HSP70催化”。尽管DNAJC9先前被鉴定为不溶性组蛋白H3.1纯化物，但DNAJC9是直接结合组蛋白还是显示组蛋白变异型特异性尚不清楚。作者发现DNAJC9直接与H3.3-H4结合，利用重组蛋白与MCM2形成共伴侣复合物（图1D）。细胞提取物中组蛋白H3变体的Pull-Down结果显示DNAJC9与H3.1/2/3相关，但与中心粒CENPA或睾丸特异性H3.1T变体无关（图1E）。综上所述，作者认为DNAJC9结合体细胞非嵌合组蛋白H3变体的方式为：以兼容组蛋白与MCM2和TONSL两者中的任意1-2个共结合的方式直接结合。作者发现DNAJC9能将组蛋白组装到松弛的环状质粒DNA上，其效率与ASF1A相当，但弱于NASP （图1F）。这些结果共同表明，DNAJC9是一种真正的组蛋白。因此，DNAJC9编码组蛋白伴侣和热休克伴侣的双功能，将HSP70分子伴侣的蛋白折叠活性导向组蛋白H3和H4（图1G）。 图1 DNAJC9双组蛋白伴侣和热休克伴侣的鉴定
A，组蛋白H3-H4（分别为红色和青色）结合模式的图式表征MCM2（深绿色）和TONSL（黄色）突出组蛋白结合突变体和组蛋白依赖干扰子鉴定的实验策略。描述了假想的组蛋白依赖性干扰物（分别为MCM2和TONSL的有色淡绿橙）和组蛋白非依赖性干扰物（灰色）；B、C，利用质谱技术分析可溶性细胞提取物中的SILAC标记的野生型（WT）和组蛋白结合突变体（HBM）形式的MCM2（B）和TONSL（C），2个生物重复。另见表S1；D，与预先组装的H3.3-H4（上）和MCM2 HBD-H3.3-H4复合物（下）混合的全长GST-DNAJC9的下调；E，与来自可溶性细胞提取物的对照纯化物（Dox+）相比，强力霉素（Dox+）诱导FLAGHA标记组蛋白H3变体的下调。Western blots代表2个生物重复；F，质粒超螺旋法显示DNAJC9的组蛋白伴侣活性，与ASF1A和NASP HBD作阳性对照。R，松弛DNA，S，超螺旋DNA；F，模式分析显示DNAJC9的N端J结构域能够刺激HSP70的催化以及DNAJC9、MCM2和TONSL之间形成的组蛋白依赖的相互作用。 2. DNAJC9识别组蛋白H3-H4二聚体的分子基础
由于DNAJC9与组蛋白H3和H4直接结合，并与MCM2形成共伴侣复合物（图1D），作者开始探索DNAJC9识别组蛋白H3和H4的分子基础。作者的截断分析鉴定出aHBD （氨基酸171-249）位于DNAJC9的C端部分（图2A和2B，图S1A ）。为防止纯化过程中二硫键交联，DNAJC9的Cys243变异为丝氨酸，不影响组蛋白结合（图S1B）。作者获得了DNAJC9 HBD C243S与组蛋白H3.3（57-135）和H4以及MCM2HBD（61-130）的复合物的晶体，并利用以前的MCM2 HBD-H3.3-H4复合物的结构，通过分子置换的方法，在2.50 Å分辨率解出了该复合物的结构（图2C，x射线统计见表1）。DNAJC9 HBD-H3.3-H4-MCM2HBD四元复合物的两个拷贝在一个不对称单元中，与0.47 Å的小均方根偏差（RMSD）几乎完全相同（图版S1C）。该结构显示DNAJC9和MCM2上的HBDs存在一个H3.3-H4二聚体作为共伴侣（图2C和2D）。如前所示，MCM2包绕着H3.3-H4二聚体的横向DNA结合界面，而DNAJC9识别出主要位于H3.3 α2螺旋上的相对疏水的表面。DNAJC9 HBD采用两个标签为αA和αB的残基，每个约30个残基长，由一个Lb环连接。DNAJC9HBD的α9螺旋与H4 L1和H3.3 L2环相互作用，而α9螺旋与H3.3α2螺旋形成反平行盘绕的线圈状结构。此外，乙螺旋的氮端部分在空间上阻止了H3-H4四聚化，，否则这种四聚化会在MCM2-H3.3-复合物和核小体中形成（图S1D和S1E）。αB螺旋也与αB螺旋形成空间冲突，这意味着DNAJC9和ASF1A/B与H3-H4二聚体的结合是相互排斥的（图2E）。若要结合H3-H4二聚体，DNAJC9αB螺旋也会模糊SPT2 αC1螺旋的结合位点（图S1F）。其中，SPT2主要接触H3-H4四聚体背景下的H3-H4二聚体。此外，H4的碳末端尾在被DNAJC9 HBD识别后采用螺旋构象，不同于在其他伴侣-组蛋白复合物中观察到的构象和核小体水平 （图2E；图S1D和S1E）。这与观察到的H4的碳末端尾部可以作为组蛋白伴侣识别的“手柄”相一致。图2 DNAJC9和MCM2的结构同时结合在一个H3.3-H4二聚体上
A，DNAJC9、H3、H4、MCM2的域架构示意图；B，GST-DNAJC9构建的蛋白质截断结构的Pull-Down实验，以绘制与预先组装的MCM2 HBD-H3.3-H4复合物的相互作用域。H3.3-H4配合物的类似GST-DNAJC9的Pull-Down结果见图S1A；C，DNAJC9 HBD-H3.3-H4-MCM2 HBD四元配合物的结构，其中DNAJC9HBD为品红色，H3.3为蓝色，H4为绿色，MCM2 HBD为粉红色。参见表1和图S1；D，DNAJC9 HBD（品红色）和MCM2HBD（粉红色）包裹在H3.3-H4二聚体表面，根据静电势着色（红色，带负电;蓝色,带正电）；E，DNAJC9 HBD-H3.3-H4-MCM2 HBD （颜色参见C）与MCM2 HBD-H3.3-H4-ASF1B（银;PDB: 5 BNX）。DNAJC9 HBD的αB螺旋与ASF1B形成空间冲突。H4 C端（C-ter,橙色）与DNAJC9HBD结合时采用螺旋构象，与ASF1B形成b链。参见图S1。 表1 数据收集和细化统计 DNAJC9 HBD与MCM2 HBD有少量接触（图S1G），同时与H3.3和H4有广泛的互作。DNAJC9的αA螺旋的残基Glu195和Glu199分别与H4 L1环中的Arg45和Lys44建立盐桥；αA中的Glu196在H3.3 L2环中与Val117和Thr118之间形成氢键；Val117位于H3.3 L2环中，Ile112位于H3.3α2螺旋中（图3A和3B）。氨基酸残基Ala197和Ser203，以及DNAJC9环的Leu207和Leu209进一步促进了与H3.3的疏水相互作用（图3B）。此外，αB的残基Gly212、Val213、Leu216、Ile220和Gln224结合在由Asp106、Leu109、Cys110和His113以H3.3 α2螺旋构成的连续通道中；H3.3 α3螺旋中的Ala127、Ile130和Arg131以及H4的C末端的Tyr98（图3C）。值得注意的是，Arg223和Arg227在H3.3 α2螺旋中与Glu105和Asp106建立了显著的极性相互作用（图3C）。此外，氨基酸残基Met231、Phe234、Leu235、Met238和Tyr242被结合到由H4α3螺旋的Ala87、Ala91、Glu94和Ala95以及H4 α3螺旋的Ala83、Met84、Val87、Leu90和Lys91组成的另一个连续通道中（图3D）。Glu239和Ser243残基也与H4 α3螺旋有一些相互作用（图3D）。值得注意的是，DNAJC9 HBD上的大多数相互作用残基在真核生物中非常相似（图3A），这意味着DNAJC9作为组蛋白伴侣的功能得到了保护。与作者的结构观察一致，Pull-Down分析显示一个αA的多突变体（4A1: E195A E196A E199A A200E）和三个独立的αB双突变体（Q224A R227A;F234A L235A;M238A Y242A）减少了DNAJC9HBD与MCM2 HBD-H3.3-H4复合物的结合，而αB双突变体L216A I220A与多个“4A”突变体（Q224A R227A M238A Y242A）的相互作用几乎完全中断（图3E）。等温滴定量热（ITC）结果证实，DNAJC9 HBD的4A突变体破坏了H3.3-H4的结合，进一步表明DNAJC9 HBD对H3.3-H4和典型H3.1-H4二聚体具有相似的结合亲和力（K_d分别为55.0±19.7和39.5±4.9 nM;图3F）。因此，DNAJC9 HBD与H3.3Ala87（H3.1和H3.2中的Ser87）接触并不能区分这些H3变体（图3D）。结构和生化结果都支持这一观点，即DNAJC9 HBD的αB螺旋是H3.3-H4识别的主要决定因素（图3）。DNAJC9中的αB螺旋（C243S）被分离后在一个单独的1.80 Å分辨率的晶体结构中被观察到（图S1H;x射线统计如表1），与DNAJC9HBD-H3.3-H4-MCM2的HBD结构有相同的结合位点（图2C）。有趣的是，DNAJC9 HBD αB与CENPA特异性伴侣HJURP的αA螺旋结构相似（图S1I），尽管它们没有显著的序列相似性。总之，作者阐明了新的组蛋白伴侣DNAJC9识别组蛋白H3-H4二聚体的分子基础。图3 DNAJC9识别H3.3-H4的分子基础
A，DNAJC9HBD的多序列比对:H.sapiens （NP_056005）、M. musculus（NP_598842）、G. gallus（NP_001186454）、X. laevis（NP_001089275）、D.rerio（NP_001002433）、D. melanogaster（NP_001262473）和S. pombe（NP_594359）。红色方块表示DNAJC9与H3.3-H4相互作用残基;“4A”强调了多个突变体与H3.3-H4的相互作用中断;黑色方块表示DNAJC9 HBD与MCM2HBD相互作用的残基；B-D，放大图显示了DNAJC9 HBD（品红色）和H3.3-H4（蓝色和绿色）之间的相互作用细节；E，DNAJC9 HBD突变体对GST下拉结合组蛋白的影响4A1和4A分别对应突变体“E195AE196A E199A A200E”和“Q224A R227A M238A Y242A”。基于重复实验的H3.3定量（n=3），以平均值±SEM百分比表示。同一凝胶WT lane的H3.3信号设置为100%；F，DNAJC9 HBD WT和4A突变组蛋白的ITC结果（n=3个独立实验，误差条表示平均值±SD）。DNAJC9 HBD WT结合H3.3H4和H3.1-H4, Kd分别为55.0±19.7 nM和39.5±4.9 nM。Kd值代表独立测量的平均值±标准差（n=3）。DNAJC9 HBD4A突变体与H3.3-H4无结合（n=3）。 3. DNAJC9招募HSP70催化折叠H3-H4底物
为了将DNAJC9置于组蛋白供应通路中，作者使用SILAC标签交换共免疫沉淀策略确定了DNAJC9相互作用组的依赖性。根据体外分析（图3E），DNAJC9突变体（Q224AR227A和M238A Y242A）显示组蛋白结合部分丢失，因此，细胞提取物中的MCM2结合减少（图S2A）。因此，作者使用较强的组合突变体DNAJC9 4A （Q224A R227A M238A Y242A）进行进一步分析（图3E），对比DNAJC9 WT和4A突变体的互作序列，证实了4A突变体中组蛋白、MCM2和TONSL缺失（图4A;图开通）。此外，作者还发现了与热休克分子伴侣机制蛋白（HSP7C, HS71B,BAG2）的特异性相互作用，这些相互作用部分是组蛋白依赖的（HSP7C, BAG2）（图4A）。为了了解DNAJC9在热休克因子招募到组蛋白底物中的作用，作者测定了DNAJC9、HSP7C和BAG2消耗对可溶性H3.1和H4相互作用子的影响（图4B;图S3）。此外，多个HSP70酶（HSP7C,HSP71B, HSP72和HSP74）和核苷酸交换因子（BAG2和HS105）依赖于DNAJC9来结合H3.1和H4（图4B;图S3A-S3C、S3H、S3I）。HSP7C的丢失伴随着组蛋白与其他hsp70型酶，HS71B和HSP72结合的增加（图4B;图S3D、S3E、S3H和S3I），可能反映了HSP7C损失的补偿，与之前的研究一致。同时，DNAJC9在组蛋白结合方面不依赖于HSP7C或BAG2（图4B;图S3D-S3I）。总的来说，这项结果支持了DNAJC9在招募hsp70型分子伴侣机制到组蛋白H3-H4底物中的作用。DNAJC9的消耗也显著降低了组蛋白伴侣蛋白SPT2、TONSL和MCM2的组蛋白负荷（图4B）。与此同时，组蛋白H3.1-H4与FACT复合物（SPT16和SSRP1）以及组蛋白H3.3的特异性伴侣DAXX一起积累（图4B;图S3B），后者不伴随着H3.3特异性肽的获得（图S3J）。这表明，未能将热休克分子伴侣机制招募到H3.1-H4中，扰乱了组蛋白供应链，导致H3.1-H4与DAXX异常积累，可能处于错误折叠状态，因此解释了组蛋白变异特异性的丧失。为了测试组蛋白进入供应链是否需要DNAJC9功能，作者在H3.1中引入了两个突变，E105A D106A（ED105AA），它们位于H3.2和H3.3中保守的位置，并且在结构上预测会破坏与DNAJC9的结合（图3C）。蛋白质组学比较显示，H3.1 ED105AA中缺失DNAJC9，以及几个对H3.1- h4蛋白提供关键的组蛋白伙伴，包括NASP、ASF1A/B、MCM2和af -1（图4C），这与H3.1供应通路上游的缺陷一致；H3.1 ED105AA突变体也显示出与组蛋白H4的关联受损（图4C）。该突变体的组蛋白异二聚缺陷不是内在的，因为能够在体外重建H3.3ED105AA-H4复合物（图4D）。与作者的结构数据一致，H3.3ED105AA突变在体外取消了与DNAJC9的结合，但在直接结合分析中，该突变并不影响与其他组蛋白伴侣ASF1A、MCM2、NASP和SPT2的相互作用（图4D）。因此，H3.1ED105AA-H4异质二聚中的细胞缺陷与DNAJC9结合的丢失有关，阻止了组蛋白进入组蛋白伴侣供应途径。与其对应的现象表现为H3.1T突变体未能结合DNAJC9（图1E）也伴随着组蛋白H4、ASF1A/B和CAF-1以及热休克因子的丢失（图S2C）。总之，本研究表明DNAJC9依赖的热休克分子伴侣机制的募集是体内H3-H4异源二聚体形成的必要条件。图4 DNAJC9招募热休克分子伙伴机制来折叠组蛋白H3-H4底物
A，DNAJC9WT, 4A突变体和对照纯化，通过三重硅铝基质谱分析。n=2个生物重复的平均比率；B，从DNAJC9、BAG2或HSC7C提取的细胞小干扰RNA （siRNA）中纯化组蛋白，与对照（CTRL） siRNA相比，使用无标记质谱分析（s0=0.5，假发现率[FDR]=0.05, H3.1 n=5和H4 n=4个生物重复）。气泡图的颜色表示中值归一化LFQ强度（siRNA/siCTRL）的Log₂比值，半径代表变化的显著性（s0=0.5, FDR=0.05）。没有显示计算值；C，从可溶性提取物中纯化的组蛋白经过无标记质谱分析（n=3个生物重复，s0=0.5, FDR=0.05）。火山图代表中值归一化LFQ强度（LFQ_M.N.）的差异，缺失值是由于在两个重复中观察了三次的因素造成的；D， GST下拉分析显示H3.3 WT-或H3.3 ED105AA-H4与选定的组蛋白伴侣结合。在A-C中，蛋白质被称为人类UniProt蛋白质识别代码。参见图S2和S3以及表S1。 4. J结构域功能的丧失将组蛋白结合的DNAJC9捕获在整个染色质全基因组中
为了进一步分析DNAJC9导向的HSP70催化的需求，作者以DNAJC9的HPD基元为靶点，这是J结构域蛋白中的一个保守基元，已知能结合并刺激ATP水解HSP70。作者构建了基于WT或HBM（4A）的表达缺陷型突变（H43Q和D45N），分别形成突变体J和4AJ（图5A）。由于DNAJC9的J突变体具有催化死亡的特性，作者预测，如果需要HSP70活性来重新折叠组蛋白并将其转移到其他组蛋白伴侣，DNAJC9可能会积累潜在的错误折叠组蛋白。通过细胞分馏实验，作者发现了一定比例的DNAJC9的J突变体以依赖于组蛋白结合的方式被困在染色质上（图5B）；对预提取的细胞进行免疫荧光分析，证实了这一点（图S4A-S4C）。J突变体在整个细胞周期中都与染色质结合（图S4D），随着细胞从G1期发展到G2/M期，结合量适度增加（图S4E）。然而，没有一种DNAJC9突变体对DNA复制或细胞周期进程表现出显性影响（图S4F和S4G）。为了确定DNAJC9的潜在功能，作者采用染色质免疫沉淀法（ChIP-seq）定位DNAJC9的WT、J和4AJ突变体基因组占位（图5C-5E）。峰值归一化读计数证实了组蛋白依赖性的诱捕DNAJC9的J突变体（图5C和5D）。然而，J突变体显示了与泛组蛋白H3相似的全基因组占用模式，缺乏特定的基因组特征的富集（图5C和5E）。该研究认为，当DNAJC9不能将HSP70分子伴侣活性导向其组蛋白H3-H4时，它就会通过错误折叠组蛋白与DNA广泛的伪相互作用而被困在染色质上。图5 J域突变以组蛋白依赖的方式诱捕染色质全基因组上的DNAJC9
A，与相关突变的DNAJC9域图;B,从表达DNAJC9-MYC-FLAGWT、J或4AJ突变体的细胞中提取可溶性和染色质提取物，并与对照细胞进行Western blot。参见图S4C-E,表达DNAJC9-MYC-FLAG WT、J或4AJ突变体的细胞与对照细胞进行定量ChIP-seq。ChIP-seq读取在10 kb的窗口中以5 kb的步长进行量化。数据为n=2个生物重复的平均数据；C，在DNAJC9 WT, J, 4AJ和对照样本中显示峰值归一化ChIP-seq信号，用参考调整的百万分之数（RRPM）进行定量，以及所描述区域的原始输入读数；D，在全基因组中，以参考调整的每百万读数定量的尖峰入标准化DNAJC9 ChIPseq信号的箱形图（RRPM）,Log₂（n+1）。黑线，中位数; whisker，1.5×四分位范围；E，DNAJC9的J突变体在基因体和基因间区域上的输入校正信号箱形图（左）或活性基因和非活性基因解析的基因体（右）。黑线,中位数;whisker，1.5×四分位范围。 5. DNAJC9在染色质供应和交易过程中保护组蛋白
为了阐明组蛋白底物需要DNAJC9介导的HSP70折叠活性的背景，作者比较了DNAJC9 WT、J和4A相互作用组在可溶性和染色质组分中的作用（图6A;图S5和S6）。与预期的一样，J突变体失去了与热休克分子伙伴机制的相互作用，同时，在两个组分中，突变体积累了组蛋白H3-H4（图6A）。这说明HSP70催化作用是DNAJC9释放组蛋白所必需的。在可溶性部分，J突变体捕获了组蛋白依赖的相互作用子的子集，包括HAT1复合物（HAT1-rbap46 /RBBP7）和大量的核糖体和RNA结合蛋白（图6A和6B）；同样，HAT1与组蛋白H3.1 ED105AA缺失的突变体在DNAJC9结合和H3-H4异源二聚中积累（图4C）。然而，作者在可溶部分并没有检测到其他下游组蛋白伴侣（如MCM2、ASF1A/B、NASP和FACT）的诱捕载体。这与在缺少正常DNAJC9功能的情况下，错误折叠的组蛋白不能进入流水线相一致；相反，它们在与HAT1的复合物中停滞不前，并与可溶性RNA非特异性地相互作用。根据这一结论，J突变体的表达引发了可溶性组分中组蛋白H3和H4的积累（图6C）。在染色质部分，HSP70催化作用的去除导致了DNAJC9相互作用子的急剧增加（34个WT和404个J突变体），与染色质假定的普遍相互作用一致（图S6B;表S1）。与DNA复制相关的组蛋白沉积因子（包括MCM2、TONSL和CAF1复合物）和转录因子（包括SPT2和SPT6）是J突变体中最显著的捕获因子（图6A;图S6E和S6G）。此外，活性CMG解旋酶和RNA聚合酶组分也与J突变体共纯化（图6A），这表明DNAJC9指导HSP70催化作用，帮助参与活性复制和转录的伴侣蛋白折叠/释放组蛋白。重要的是，相同的组蛋白伴侣（MCM2、TONSL、CAF-1、SPT2和SPT6）以及热休克因子（HSP7C和HS71B）是DNAJC9 WT染色质纯化中富集最多的因子（图6D）。综上所述，DNAJC9通过招募HSP70s释放染色质上具有组蛋白沉积因子的异常中间体（caf1、MCM2、SPT2和SPT6）中捕获的组蛋白，从而促进组蛋白H3-H4沉积，这将允许错误折叠的组蛋白被清除并循环进入沉积途径（图7）。 图6 DNAJC9导向的HSP70活性有助于组蛋白供应和染色质
A-D，DNAJC9WT、突变体和从可溶性和染色质提取物中得到的对照纯化（n=6个生物重复）。蛋白质指的是人类UniProt蛋白质鉴定代码。参见图S5和S6以及表S1；A，从（左）可溶性和（右）染色质部分纯化得到的气泡图显示J结构域和组蛋白结合突变体（分别为J和4A）富集（红色）和耗尽（蓝色），与标准化LFQ强度（LFQ_B.N.）计算出的WT比值相比。数据分析步骤详见图S5和S6。B，左:可溶分数LFQ_B.N.的欧氏聚类分析。在WT、J或4A突变体的6个实验中至少6个实验中确定的因子强度，并且在控制纯化的至少一组中额外显著富集（S0=2, FDR=0.01）。重点关注区域突出（黑盒子）和放大（右）显示组蛋白、核糖体蛋白、HSP70和其他因子的富集和减少趋势；C，表达DNAJC9 WT、J或4A突变体的细胞和对照细胞可溶性提取物的Western blot结果显示，在表达DNAJC9的J突变体的细胞中有可溶性组蛋白的积累；D，在DNAJC9 WT纯化中最显著富集的因子的STRING-db网络，以及在J和4A突变体中富集/耗尽的覆盖比。Log₂ (LFQ WT/C）_B.N.的22个节点中的16个> 1.8在STRING置信水平0.6下彼此连接;红边表示与实验证据连接的节点。 图7 DNAJC9将热休克生物学与组蛋白伴侣网络连接起来
由于组蛋白伴侣是单体的、错误折叠的或与RNA/DNA假相互作用，DNAJC9结合的组蛋白底物不能与其他组蛋白伴侣结合。DNAJC9通过其J结构域招募HSP70型酶，利用ATP衍生的能量折叠和释放组蛋白底物。DNAJC9结合的组蛋白可以进入HAT1上游的组蛋白伴侣供应链，最终通过ASF1传递到染色质。另外，DNAJC9结合的组蛋白二聚体绕过ASF1，在DNA复制和转录过程中参与组蛋白沉积伴侣。

讨论

作者发现DNAJC9将热休克分子伴侣活性整合到组蛋白伴侣网络中，促进错误折叠和被困的组蛋白进入/再进入生产组蛋白供应链和沉积中间体。作者的数据支持这一观点，即DNAJC9与经典的组蛋白伴侣蛋白共同作用，在组蛋白H3-H4二聚体供给和沉积最具挑战性的阶段，招募热休克因子来保护其结构完整性。这似乎在组蛋白合成后不久，以及之后在染色质的沉积位点尤为重要，可能是为了通过与核糖体RNA和DNA的非特异性相互作用释放组蛋白，通过DNAJC9折叠/再折叠的组蛋白重新进入HAT1上游的组蛋白供应链或与复制（CAF1、MCM2和TONSL）和转录（SPT2和SPT6）相关的活性组蛋白沉积位点（图7）。作者的结构表明，DNAJC9与完全折叠的H3-H4二聚体结合，这可能是催化反应的快照，可以预见，这是预折叠组蛋白捕获的HSP70催化循环的端点。在这种构象中，组蛋白能够重新参与其他组蛋白伴侣，这也被DNAJC9结合的组蛋白与MCM2的共结晶所证明。通过结构分析，作者发现DNAJC9与ASF1和SPT2具有竞争性的结合模式，但作者发现DNAJC9与两种组蛋白伴侣之间存在有趣的相互作用。DNAJC9向SPT2提供组蛋白，它与SPT2形成一个组蛋白独立的相互作用，可以被J结构域突变体捕获在染色质上。这些观察结果指向DNAJC9和SPT2之间需要HSP70催化的组蛋白转移。相比之下，功能蛋白质组学数据支持DNAJC9与ASF1之间的互斥关系，因为它们的组蛋白伴侣包括MCM2、TONSL和CAF-1有重叠。这表明DNAJC9为细胞提供了一条通路，绕过以ASF1为中心的组蛋白H3-H4供应通路，最终参与相同的沉积机制。这对于保留由于错误折叠或与RNA/DNA非特异性关联而脱离供应链的组蛋白可能特别有用。数据支持两个DNAJC9依赖的组蛋白进入HSP70催化循环的切入点（图7），通过这个切入点，组蛋白单体或被捕获/错误折叠的H3-H4二聚体可以进入。依赖于进入点和细胞环境，DNAJC9可以与一种或多种HSP70型酶结合，释放完全折叠的组蛋白底物，形成生产供应和沉积复合物。作者发现DNAJC9在参与NASP和其他组蛋白伴侣之前促进H3-H4的异二聚。与此一致的是，DNAJC9与HSC70和HSP70（HSP7C,HS71B）形成组蛋白依赖和独立的相互作用，这些相互作用分别在与组蛋白单体H3.1和H4的单独复合物中被观察到，因此，DNAJC9具有催化新生H3-H4异二聚体化所需的联合属性。最令人惊讶的发现是，DNAJC9的组蛋白折叠功能不仅在其可溶性生命的开始阶段使用，而且在组蛋白沉积在染色质上的最后阶段也使用。这表明组蛋白伴侣的功能不一定在线性组装通路中表达；相反，组蛋白伴侣基于与组蛋白构象的相容性和组蛋白伴侣的机会性结合，如果蛋白质的负荷和亚细胞定位正确，可以发生在整个供应过程中。事实上，DNAJC9可能促进了许多组蛋白交易，从而对H3-H4倍的稳定性产生了特殊的影响，这包括在组蛋白伴蛋白和核酸的非生产性高亲和力中间体释放组蛋白的过程中（图7）。在这种情况下，DNAJC9提供了一种保障机制，确保组蛋白H3-H4二聚体的结构完整性。组蛋白异二聚体在特定的细胞环境中具有一定的可塑性，这一事实为根据组蛋白构象动力学介导组蛋白切换事件提供了有趣的可能性，如前所述。因此，伴侣的可用性和组蛋白构象通过选择性引导组蛋白进入竞争沉积途径，很有可能影响染色质状态，正如DNAJC9缺失时DAXX重新连接结合H3.1所证明的那样。总之，作者的工作确定了一个持续的热休克分子伴随组蛋白的需求，包括在生物合成、复制和转录过程中，由DNAJC9的双重功能满足。这为确保有效组蛋白供应的多层面控制增加了另一层，其中还包括详尽的转录和翻译调控。尽管组蛋白共同伴侣复合物提供了屏蔽多个组蛋白功能表面的手段，但似乎仅被动屏蔽能力不足以充分保护组蛋白H3-H4；相反,细胞直接利用ATP来源的能量和HSP70酶来重新折叠组蛋白, 以促进他们的供应和互作（图7）。“分子伴侣”一词最初被用来描述一种在生理盐条件下与DNA混合时能够防止组蛋白沉淀的蛋白质。自从这个最初的发现，“分子伴侣”术语已经被扩展到热休克蛋白功能，而最初的定义现在被用来定义“组蛋白伴侣”。DNAJC9结合了组蛋白伴侣功能和分子伴侣功能。本研究的结构分析报导了DNAJC9结合折叠组蛋白H3-H4二聚体的构象，催化折叠的机制尚未完全阐明。重组体系中DNAJC9刺激组蛋白H3-H4的HSP70催化折叠机制的时间分辨生化和结构分析将为DNAJC9的作用模式的机制提供特殊思路。然而，DNAJC9是否起到折叠或重新折叠组蛋白的作用，在很大程度上取决于底物的生物环境和参与的分子伴侣。在细胞环境中，如果组蛋白底物参与DNAJC9，但不能完成HSP70催化循环的选择，就可能会触发组蛋白的降解途径。作者发现，DNAJC9参与组蛋白供应的多个阶段，包括在组蛋白生物合成后不久以及与组蛋白沉积伴侣的交易过程。因此DNAJC9可以支持H3-H4供应链，允许组蛋白在多个位点进入或重新进入该通路，支持以ASF1为中心的H3-H4供应链。DNAJC9已经被CRISPR筛选鉴定为一个跨越大量癌细胞系的必要基因。鉴于DNAJC9与组蛋白代谢的多种联合方式，目前亟待解决的问题是了解DNAJC9是如何对细胞存活起作用的。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33857403/

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