科研 | 华中农业大学：赖氨酸琥珀酰化在夜间胁迫下对飞蛾对人造光响应中的潜在作用（国人佳作）

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编译：微科盟红烧大肥鸥，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读
夜间人造光（ALAN）是一种广泛的环境污染物和压力源。研究表明，许多夜行性昆虫会遭受ALAN胁迫。但是，很少有研究揭示夜间昆虫对ALAN胁迫的反应机理。先前的研究表明，赖氨酸琥珀酰化（Ksuc）是在压力条件下协调能量代谢和抗氧化活性的潜在机制。Mythimna separata（Walker）（M. separata）是一种夜行性昆虫，受到ALAN的胁迫。在这项研究中，我们量化了ALAN胁迫的M. separata中的相对蛋白质组Ksuc水平。在466种经鉴定的Ksuc修饰蛋白中，有103种在ALAN胁迫的飞蛾中被过度琥珀酰化/去琥珀酰化。高琥珀酰化/去琥珀酰化的蛋白质显示出参与各种生物学过程，它们在代谢过程，活性氧（ROS）稳态和神经肌肉系统中富集。此外，我们证明了Ksuc可能通过在ALAN胁迫下干预和协调这些系统来影响蛾的运动。这些发现表明，Ksuc在对ALAN胁迫和蛾的运动行为的蛾响应中起着至关重要的作用，并为ALAN对夜间昆虫种群和物种群落的影响提供了新的观点。‍

论文ID

原名：Potential role of lysine succinylation in the response of moths to artificial light at night stress译名：赖氨酸琥珀酰化在夜间胁迫下对飞蛾对人造光响应中的潜在作用
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
IF：4.872发表时间：2021.05通讯作者：黄求应，雷朝亮
通讯作者单位：华中农业大学

实验设计

实验结果

1.  M. separata中 Ksuc 的全蛋白质组鉴定

M. separata赖氨酸琥珀酸组定量分析的结果如图1a所示。为了验证初始质谱数据，我们检测了所有肽段的质量误差和长度。所有鉴定的肽平均质量误差几乎为零，所有误差都小于5ppm，这意味着MS数据的质量精度满足要求(图1b)。大多数肽的长度在8~20个氨基酸之间，与胰蛋白酶肽段的长度相匹配(图1C)，这表明样品制备符合蛋白质组学分析的标准。我们利用LC-MS/MS从所有样品中分离出2692个蛋白。其中，我们在466个蛋白质中鉴定出748个Ksuc位点，占总蛋白的17%(图1D)。当Alan胁迫时，在M. separata中共有103个蛋白的137个位点被超琥珀酰化/去琥珀酰化，其中3个蛋白中有7个位点被超琥珀酰化，100个蛋白中有130个位点被脱琥珀酰化(图1D)。大约75%(349)的蛋白具有单一的Ksuc位点，6%(53)的蛋白含有3个或更多的Ksuc位点。值得注意的是，在另外10个Ksuc位点中我们发现有5个蛋白被修饰。

图1 M. separata中Ksuc的蛋白质组鉴定

(a)M. separata中 Ksuc蛋白质组学定量的实验流程。T代表治疗；C代表控制。（b）肽评分的分布。（c）胰蛋白酶肽段的长度分布。(d) M. separata 中鉴定的琥珀酰化蛋白质数量。Pr指蛋白质。（e）琥珀酰化蛋白质的亚细胞位置。

真核生物的细胞被细分为功能不同的膜结合室，并且蛋白功能和亚细胞定位密切相关。在分离到的Ksuc修饰蛋白中50%、17%、14%、7%、6%、3%和2%分别位于胞浆、线粒体、细胞核、胞外间隙、胞浆和胞核、质膜和内质网中(图1E)。胞质溶胶和线粒体是细胞代谢的重要细胞器，也是Ksuc修饰蛋白存在的主要细胞器，这表明Ksuc可能参与了M. separata的代谢途径。

2. M. separata中Ksuc 修饰蛋白响应ALAN 胁迫的功能富集

为了揭示Ksuc修饰蛋白响应Alan胁迫的特点和可能的作用，我们对基于GO的超琥珀酰化/去琥珀酸化蛋白进行了功能富集分析(细胞组成、分子功能和生物学过程)，以及结构域和KEGG途径注释。

在细胞成分类别(图2)中，相当大比例的Ksuc修饰蛋白分布在细胞质中。主要成分为胞质溶胶、肌动蛋白细胞骨架、细胞内非膜结合细胞器、非膜结合细胞器、肌球蛋白复合体、氧化还原酶复合体和核糖核蛋白复合体。这一结果表明，这些已鉴定的Ksuc修饰蛋白广泛参与细胞质过程，包括蛋白质合成、氧化还原和细胞骨架相关事件。

图2 基于GO(细胞成分、分子功能和生物学过程)、结构域和KEGG途径注释富集分析M. separata中Ksuc修饰蛋白对Alan胁迫的响应

在分子功能类(图2)中，Ksuc修饰蛋白主要在结合过程(钙离子结合、4铁结合、4硫簇结合、硫化合物结合、辅因子结合)和催化活性(磷酸转移酶、生物素羧化酶、异构酶、氧化还原酶活性)上富集。这些结果表明Ksuc在蛋白质-蛋白质相互作用和酶催化活性中起着至关重要的作用。

与上述结果一致，进一步的结构域富集分析(蛋白质结构域是指在序列中保守的特定区域，是分子功能的结构元件)显示Ksuc修饰的蛋白质在钙相关结构域(EF-Hand结构域、EF-Hand结构域对、EF-Hand结构域、Ca不敏感结构域)和细胞骨架相关结构域(免疫球蛋白亚型2、免疫球蛋白I-SET、免疫球蛋白亚型、纤维连接蛋白III型)中高度富集(图2)。此外，我们还观察到与代谢相关的结构域，包括生物素羧化酶样结构域、N-末端结构域、前ATP-GRAP结构域、氨基甲酰-磷酸合成酶大亚基结构域和ATP结合结构域(图2)。

对生物过程和KEGG途径的富集分析(图2)强调了参与各种代谢过程的蛋白质在Alan胁迫下受到Ksuc的调控(图3)。有趣的是，一组富集类别似乎与神经元和肌肉功能有关，如肌动蛋白细胞骨架、肌球蛋白复合体、钙离子结合和对钙的不敏感性。

图3 Ksuc修饰蛋白参与ALAN胁迫下M. separata代谢的蛋白质组学图谱

脱琥珀酰蛋白呈红色。超琥珀酰化蛋白为蓝色。TCA循环，三羧酸循环；ALDO，果糖二磷酸醛缩酶；TPI，磷酸丙糖异构酶；PGK，磷酸甘油酸激酶；PGAM，磷酸甘油酸变位酶；PC，丙酮酸羧化酶；ACO，乌头酸水合酶；CS，柠檬酸合酶；IDH，异柠檬酸脱氢酶；glyA，甘氨酸羟甲基转移酶；GLT，谷氨酸合酶；proA，谷氨酸5-半醛脱氢酶；MDH，苹果酸脱氢酶；SDH，琥珀酸脱氢酶；OGDC，2-酮戊二酸脱氢酶；ACSL，长链酰基辅酶A合成酶；FASN，脂肪酸合酶；ACACA，乙酰辅酶A羧化酶；fadA，乙酰辅酶A酰基转移酶；ACADS，丁酰辅酶A脱氢酶；ACAT，乙酰辅酶A C-乙酰转移酶；NDUFS8，NADH脱氢酶（泛醌）Fe-S蛋白8；QCR7，泛醇-细胞色素 c 还原酶亚基 7；COX，细胞色素c氧化酶；ATPsynF，ATP合酶F链；ATPsynB，ATP合酶b；ATPsynO1, H+运输 ATP 合酶 O 亚基同工型1。（为了解释该图例中对颜色的引用，读者可以参考本文的网络版本。）

3. Ksuc 调节 ALAN胁迫的飞蛾代谢流

ALAN 胁迫下的“飞蛾扑火”现象本质上是光刺激下的飞行行为，并可以在飞蛾暴露于光后几秒钟内迅速发生。昆虫的拍动翅膀飞行是一个耗能过程，昆虫在飞行后的几秒钟内可以表现出很高的代谢率。昆虫如何“开启”飞行代谢以及代谢酶如何从酶原状态转变为活性形式一直是人们非常感兴趣的话题。经典代谢理论将这些现象归因于肌肉收缩期间释放的 Ca²⁺和 ATP的分解以及 ADP、AMP 和 Pi 产生过程的变化。然而，这些变化的幅度已被证明不足以解释飞行代谢的大量增加。因此，这中间很可能涉及作用于该控制点的其他因素。

Ksuc在跨物种的代谢过程中相对保守。我们发现超过 25 种蛋白质/酶复合物/代谢相关酶的亚基在 ALAN 胁迫的M. separata 中被过度琥珀酰化/脱琥珀酰化（图 3）。这些蛋白质参与 TCA 循环、糖酵解、脂肪酸代谢、氧化磷酸化和氨基酸生物合成（图 3）。Ksuc广泛参与代谢过程，其水平影响代谢酶的活性。我们推测 Ksuc 会在全球范围内影响代谢蛋白质活动，类似于整个系统的“开关”。因此，我们假设 Ksuc 是飞行昆虫启动高代谢的关键机制。此外，Ksuc可能通过“开启”飞行昆虫的高代谢率，帮助协调对新陈代谢的反应，并帮助整合经典的新陈代谢途径。

4. Ksuc 调节 ALAN 胁迫下蛾的神经肌肉链接的过程

虽然已知 PTM 存在于神经系统的许多膜蛋白中，但是目前研究者没有研究调查过这些蛋白质在昆虫中的酰化状态。在这里，两个与突触囊泡相关的蛋白被琥珀酰化(图4)：网格蛋白重链(Chc)，它是网格蛋白复合物的一部分，是包被囊泡的主要成分；突触融合蛋白1A (Syx1A)，它参与突触囊泡与突触前膜的融合过程。谷氨酸是中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质，囊泡融合则是神经传导的关键过程。此外，谷氨酸门控氯通道受体只存在于无脊椎动物的神经系统中。因此，这些神经蛋白是否具有Ksuc位点值得探索。

在与谷氨酸能系统相关的3个蛋白质中，我们在谷氨酸代谢的谷氨酸脱氢酶(GDH)和谷氨酸受体的两个组分、谷氨酸门控氯通道(GluCl)的细胞内通道异构体1(Clic1)和N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)的钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)中发现了Ksuc位点(图4)。这些结果表明，Ksuc在神经传导中具有潜在的调节作用。

最近的研究表明夜间昏暗的灯光能诱发小鼠神经变性，而Ksuc水平的升高与小鼠大脑中异常的神经解剖结构有关。因此，我们推测Ksuc参与了ALAN引起的神经系统改变。这些结果是第一个直接的证据表明Ksuc与ALAN胁迫下的神经功能相关。Ksuc在神经过程中的潜在作用将是今后的重要研究方向。

图4 ALAN胁迫下M. separata神经肌肉连接处ksuch修饰蛋白的蛋白质组学图谱

带有 Ksuc 位点的蛋白质用红色表示，脱琥珀酰化的蛋白质用下划线表示。Glu，谷氨酸；Gln，谷氨酰胺；GSH，谷胱甘肽；α-KG，α-酮戊二酸；TnT，肌钙蛋白 T 转录变体 B；Tn I，肌钙蛋白 I；Tm1，原肌球蛋白1；Prm，副肌球蛋白；Mlc，肌球蛋白轻链；MLC-2，肌球蛋白调节轻链 2；Titin，酮蛋白；Actn B，α 肌动蛋白，同工型 B；SERCA，肉质（内）质网型钙 ATP 酶；Clic1，氯离子胞内通道亚型 1；CAMKII，Ca2/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II；Chc，网格蛋白重链；Syx1A，syntaxin 1A；GDH ，谷氨酸脱氢酶；TCA循环，三羧酸循环；NMDAR，N-甲基-D-天冬氨酸受体；GluCl，谷氨酸门控氯离子通道。（为了解释这个图例中对颜色的引用，读者可以参考本文的网络版本。）

我们在这里发现，许多肌肉系统成分含有Ksuc位点，在ALAN胁迫的飞蛾中，这些蛋白近一半被脱琥珀酰化(图4)。其中，根据肌肉收缩的滑丝摆动交联桥模型，TnT、TnI和Actin是参与肌肉收缩的关键蛋白。果蝇飞行肌肉中的肌动蛋白乙酰化被证明对肌肉结构和功能以及飞行性能至关重要。与乙酰化相比，琥珀酰化会引起蛋白质结构的更多变化，并可能导致其化学性质和功能发生更显著的变化。因此，我们认为Ksuc是调节肌肉收缩相关蛋白的另一个关键因素。

5.  Ksuc调节ALAN胁迫的飞蛾抗氧化系统

环境压力通过体内复杂生化过程ROS的积累显着影响昆虫的生命。多项实验表明，ALAN 会增加飞蛾的氧化应激水平。在这里，我们发现了涉及两个抗氧化系统的 9 种蛋白质，即带有 Ksuc 位点的谷胱甘肽(GSH) 系统和硫氧还蛋白 (Trx) 系统（图 5）。GSH系统对于抗氧化很重要， GSH可以从富含甲硫氨酸的贮藏蛋白（MSP）和甲硫氨酸富适度贮藏蛋白（mMSPs）被释放。在此，MSP 和 mMSP 中 ALAN 诱导的超琥珀酰化（图 5）可能有助于 GSH 介导的抗氧化。GSH 已被证明可以通过与亲电底物相互作用来保护细胞免受潜在有害的外源性物质的侵害，这通常由谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 催化。Trx系统是另一个关键的抗氧化系统，Trx可以减少通用蛋白质上的二硫化物，并作为peroxiredoxin (Prxs) 的还原剂。这些结果表明 Ksuc 可能通过控制这些酶和蛋白质的活性和氧化还原状态来调节抗氧化系统。

图5 ALAN胁迫下M. separata GSH/TRX抗氧化系统中Ksuc修饰蛋白的蛋白组学图谱

带有 Ksuc 位点的蛋白质用红色标记。超琥珀酰化/脱琥珀酰化的蛋白质标有下划线。向上箭头代表超琥珀酰化，向下箭头代表去琥珀酰化。GSH，谷胱甘肽；GSSG，谷胱甘肽二硫化物；GPx，谷胱甘肽过氧化物酶；GR，谷胱甘肽还原酶；NADP，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；NADPH，三磷酸吡啶核苷酸；IDH，异柠檬酸脱氢酶；ALDH、醛脱氢酶；G6PD，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；6GPD，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；RX，亲电试剂；GST，谷胱甘肽-S-转移酶；Prx，过氧还蛋白；Trx，硫氧还蛋白；TR，硫氧还蛋白还原酶；Ox，氧化；红色，减少；MSP，富含蛋氨酸的储存蛋白；mMSP，中等富含蛋氨酸的储存蛋白。（为了解释这个图例中对颜色的引用，读者可以参考本文的网络版本。）

GSH 和Trx的活动要求它们处于活跃的、简化的形式。因此，氧化型谷胱甘肽 (GSSG) 和氧化型 Trx 分别通过 GR 或 TR 被 NADPH 迅速还原。因此GSH 和 Trx 系统都使用 NADPH 作为最终的电子供体。有趣的是，几种产生NADPH 的酶已被证明具有 Ksuc 位点，包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PD)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 (6PGD)、异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 和醛脱氢酶 (ALDH)，这意味着 Ksuc 可能通过调节产生 NADPH 的代谢酶来控制抗氧化系统。

6.  Ksuc在飞蛾对ALAN响应中的潜在作用

我们发现了可能存在 Ksuc 的系统间相互作用（图 6）。首先，所有生物体都需要能量来维持生命活动，代谢系统因此直接影响神经传导和肌肉收缩。此外，ROS稳态与代谢密切相关，能量底物可以重新定向到特定的代谢途径，这不仅产生抗氧化分子（NADPH 和 GSH）和氧化还原辅因子（即 NADH 和 FADH），并且可以很容易地维持或恢复足够的氧化还原稳态。反过来，ROS 是代谢调节剂，氧化应激可以控制癌细胞的代谢重编程。ROS稳态通过新陈代谢间接影响神经传导和肌肉收缩。最后，神经和肌肉系统协同工作以进行运动。因此，我们假设Ksuc 可能通过干预和协调这些系统来影响运动。

图6 涉及KSUC系统间可能的相互作用

结论

在这项研究中，我们定量分析了ALAN胁迫下M. separata中相对蛋白质组的Ksuc水平，这是首次在夜行性昆虫中进行的定量 Ksuc 蛋白质组学分析。我们展示了现代蛋白质组学和生物信息学分析在具有农业和生态意义的飞蛾蛋白质分析中的应用。所鉴定出的Ksuc修饰蛋白与代谢过程、ROS稳态和神经肌肉系统有关。Ksuc 可能通过在ALAN 压力下干预和协调这些系统来影响飞蛾的运动。由于运动在生存和繁殖中的关键作用，ALAN 确实可以成为强大的选择力量并影响飞蛾物种群落。ALAN引起的物种群落变化可能反过来影响相关的生态系统功能和过程。我们提供了关于ALAN 对夜间昆虫种群和物种群落的影响的新视角，并对 ALAN 影响夜间活动动物的分子机制做出了新的预测。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34020284/

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