科研 | J. Inflamm. Res.: 硫酸葡聚糖钠诱导的结肠炎小鼠的系统代谢谱（国人佳作）

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编译：微科盟宁宁宁，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

炎症性肠病(IBD)是一种影响几乎全身组织的慢性炎症性疾病。从前的研究主要集中在IBD患者的呼吸、粪便和尿液样本上。然而，目前还没有对血清、结肠、心脏、肝脏、肾脏、皮质、海马体和棕色脂肪组织等生物样本开展系统代谢组学分析。因此，本研究的目的是通过靶组织代谢组学分析研究其与IBD发病机制的联系，为早期诊断和治疗IBD疾病寻找新的生物标志物。本研究将雄性SD小鼠随机分为对照组和葡聚糖硫酸钠（DSS）处理组，DSS连续口服6周进行造模。用气相色谱-质谱连用技术（GC-MS）测定代谢物，并采用多元统计分析进一步鉴定两组间差异代谢物。研究结果显示，DSS处理组大鼠与正常组大鼠相比，血清、结肠、心脏、肝脏、肾脏、皮质、海马体和棕色脂肪组织中分别有3、11、12、6、5、13、13和11种差异代谢物。变化最为显著的代谢物包括氨基酸(L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-赖氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸、L-去亮氨酸、L-缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、L-苏氨酸)、有机酸(柠檬酸、3-羟基丁酸、丙酸)、糖类(D-阿拉伯糖、D-果糖）及嘌呤（9H-嘌呤-6-醇，D-核糖）。这些代谢物主要参与了氨基酸代谢通路(如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢)及嘌呤代谢通路(氨基酰tRNA生物合成)。本研究采用气相色谱-质谱联用技术对IBD代谢物变化进行分析，为IBD及其相关疾病提供更全面的认识，提高对IBD发病机制的认识。

论文ID

原名：Systematic Metabolic Profiling of Mice with Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis译名：硫酸葡聚糖钠诱导的结肠炎小鼠的系统代谢谱
期刊：Journal of Inflammation  Research
IF：6.922发表时间：2021.07通讯作者：张美华、江沛
通讯作者单位：滕州市中心人民医院、济宁市第一人民医院

实验设计

实验结果

1. DSS诱导的大鼠结肠炎模型评价
疾病活动指数（DAI）是结合患者的体重下降百分率、大便黏稠度和大便出血三种情况进行的综合评分，将3项结果的总分除以3即得到DAI值。在图1A中，DSS处理组的DAI指数显著高于对照组大鼠。图1B为DSS处理组和对照组大鼠的结肠部位H&E染色结果，对照组大鼠结肠粘膜完整，而DSS处理组大鼠结肠内可见炎性细胞浸润，粘膜及粘膜下层增厚，上皮糜烂。此外，DSS处理组的促炎细胞因子IL-1β(图1C)、IL-6(图1D)和TNF-α(图1E)均明显高于对照组。                           图1 模型评价
A，疾病活动性指数评估；B，DSS处理组结肠炎大鼠和对照组大鼠结肠组织病理学分析（HE染色，200×）；促炎细胞因子IL-1β（C），IL-6（D），TNF-α（E）的mRNA表达。数据均为means±SD（n = 7），* P<0.05，** P <0.01为与对照组相比。 2. 组织样本的GC-MS总离子流图
各组织的质量控制样本（QC，对照和DSS处理的组的混合物）的GC-MS总离子流图如图2所示。所有样品均显示出了较强信号和良好的保留时间再现性。图2 GC-MS总离子流图
A-H,分别代表血清，结肠，心脏，肝脏，肾，皮质，海马体以及棕色脂肪组织。 3. 多元变量统计分析
在本研究中采用OPLS-DA分析及SPSS分析来进行GC-MS数据的模型判别。DSS处理组大鼠与正常组大鼠相比，血清、结肠、心脏、肝脏、肾脏、皮质、海马体和棕色脂肪组织中分别有3、11、12、6、5、13、13和11种差异代谢物，如表1所示（VIP＞1，P＜0.05）。在图3中，OPLS-DA模型参数（血清：R2x = 0.735，R2Y = 0.992，Q2 = 0.386;结肠：R2x = 0.538，R2Y = 0.977，Q2 = 0.792; HEART：R2X = 0.76，R2Y = 0.992，Q2 = 0.966;肝脏：R2X = 0.819 ，r2y = 1，q2 = 0.935;肾脏：r2x = 0.89，r2y = 1，q2= 0.944;皮质：r2x = 0.87，r2y =0.999，q2 = 0.963;海马体：r2x = 0.718，r2y = 0.988，q2 = 0.961 ;棕色脂肪：R2x = 0.86，R2Y = 1，Q2= 0.951）显示该模型是有效的，可以清楚地区分DSS组和对照组。每个参数值接近1.0，表示模型预测可靠。图3中的置换检验显示Q2回归线在y轴上的截距均低于零，进一步说明了模型的可靠性。 表1 血清，结肠，心脏，肝，肾，皮质，海马体和棕色脂肪代谢差异物列表（DSS处理组VS对照组） 
图3 OPLS-DA模型预测及置换检验结果
A-H,分别代表血清、结肠、心脏、肝、肾、皮质、海马体和棕色脂肪。 将代谢组学数据进一步使用MetaboAnalyst5.0进行两组之间的代谢差异分析。通过聚类分析发现大多数样本被分成两组，只有小部分样品簇重叠（图4）。这些结果与OPLS-DA预测的结果一致。图4 聚类热图分析
A-H,分别代表血清、结肠、心脏、肝、肾、皮质、海马体和棕色脂肪；红色代表上调，蓝色代表下调；行对应于样本，列对应于代谢物。 4.代谢通路分析
在本研究中MetaboAnalyst 5.0用于分析对照组和DSS组之间差异代谢物所富集的代谢途径。我们进一步确定了11种显着的代谢途径（P <0.05，impact> 0）。血清代谢通路分析中主要包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；结肠代谢通路分析中包括氨基酰基-TRNA生物合成、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸酯代谢以及GSH代谢；心脏代谢通路分析中包括丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、以及苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成。皮质代谢通路分析中包括精氨酸生物合成、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、GSH代谢、乙醛酸和二羧酸酯代谢、嘌呤代谢和苯丙氨酸以及酪氨酸和色氨酸生物合成;海马代谢通路分析中包括精氨酸生物合成、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸酯代谢、嘌呤代谢和GSH代谢、以及苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成。棕色脂肪代谢通路分析中则主要包括氨基酰基-TRNA生物合成、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢和半胱氨酸和蛋氨酸代谢。具体的代谢通路途径分析细节如表2和图5所示，而图6则进一步归纳出关键核心通路网络。表2 MetaboAnalyst 5代谢通路分析结果
图5 MetaboAnalyst 5.0途径代谢通路分析气泡图
（a）丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，（b）精氨酸生物合成，（c）乙醛酸和二羧酸甲酯代谢，（d）嘌呤代谢，（e）谷胱甘肽代谢，（f）苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成，（g ）D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，（H）精氨酸和脯氨酸代谢，（i）氨基酰基-TRNA生物合成，（j）半胱氨酸和甲硫氨酸代谢，（k）甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢。 图6 与对照组相比，DSS处理组靶组织中代谢物和代谢途径的示意图
（黑箭头：精氨酸生物合成;红色箭头：D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢;蓝箭头：丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢;淡绿色箭头：嘌呤新陈代谢;橙色箭头：甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢;紫色箭头：精氨酸和脯氨酸代谢;灰色箭头：半胱氨酸和蛋氨酸代谢;绿色箭头：谷胱甘肽代谢;银色箭头：谷胱甘肽和二羧酸代谢）

讨论

IBD属于慢性肠炎疾病。目前的主流学说认为，IBD是胃肠道微生物侵袭引起的炎症反应。此外，宿主遗传学、肠道微生物群和免疫应答在IBD发病机制中起重要作用。代谢组学通过整合蛋白质及碳水化合物、能量代谢、基因表达调控和信号分子等信息，用于研究疾病的发病机制及诊断代谢物。目前，临床上还没有适合诊断使用的IBD相关代谢生物标志物。症状识别、鉴别诊断和结肠镜检查是IBD的主要诊断依据。因此，开发非侵入性代谢生物标志物为IBD的诊断提供有效的筛查方法具有重要意义。在本研究中，通过DAI评估、组织病理学分析及促炎因子测定来进行结肠炎大鼠模型评估，发现DSS能够诱导明显的结肠损伤，造成大鼠结肠炎性细胞浸润和上皮屏障破坏，病理上与溃疡性结肠炎相似。结果表明，大鼠结肠炎模型建立成功。研究中首次使用代谢组学方法确定了主要靶组织(血清、结肠、心脏、肝脏、肾脏、皮质、海马体和棕色脂肪)的系统性改变。对照组和DSS组相比，在血清、结肠、心脏、肝脏、肾脏、皮质、海马体和棕色脂肪组织中分别有3、11、12、6、5、13、13和11个差异代谢物(表1)。这些代谢物彼此密切相关(图4)，并参与11条与氨基酸、核苷酸和能量代谢相关的重代谢通路(图5)。已鉴定的代谢物和所富集的代谢通路使我们对IBD的代谢组影响有了更深入的了解。这些代谢物有可能被用作IBD诊断的生物标志物，以及进一步加深对于IBD发病机制的全面了解。本研究揭示了IBD能够引起氨基酸代谢的显著变化。氨基酸是大多数代谢途径的重要调节剂和底物。在研究中，DSS处理组和对照组之间的氨基酸代谢产物有显著差异，包括L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、牛磺酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-去亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸和甘氨酸(表1)。此外，相关途径还涉及精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成(表2)。脯氨酸对蛋白质合成和细胞生长至关重要，它还在渗透调节、蛋白质稳定性、细胞生物能量学以及抗菌或抗真菌方面发挥中药作用。血清、结肠、心脏和皮质组织中脯氨酸水平的变化表明，脯氨酸可能有助于减轻渗透压力，抵抗细菌，从而维持肠道内环境的稳定。脯氨酸被认为是一些细菌的重要能量来源，这可能可以解释为什么血清中的脯氨酸水平下降。甘氨酸是最简单的氨基酸，参与能量释放和DNA合成，可以通过抑制炎症细胞因子和趋化因子来发挥肠道保护作用。相关研究显示，IBD发作期患者的甘氨酸水平升高。在本研究中，与对照组相比，DSS处理组的结肠甘氨酸水平增加，这表明甘氨酸可能对结肠炎具有保护作用，能够减轻结肠粘膜的炎症。支链氨基酸，如L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸，参与了炎症、应激、肌肉代谢和能量生成。本研究中观察到的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸水平的变化表明，这些氨基酸可能与DSS诱导的结肠炎的炎症有关。这些研究结果可能有助于进一步确定肠炎的病理机制。IBD患者的肠道是一个复杂的病理环境，包括氧化应激、DNA损伤和异常的免疫反应。Lih-Brody在IBD患者的结肠粘膜活检组织中发现氧化应激水平增加。L-谷氨酸是蛋白质合成所必需的氨基酸，并且在细胞新陈代谢中发挥关键作用，保护细胞免受氧化应激的影响。L-谷氨酸还支持免疫和消化系统，并且参与体内能量产生。在我们的研究中，DSS处理组大鼠的L-谷氨酸水平显著升高，提示L-谷氨酸可以阻止DSS诱导而产生氧化应激效应。此外，谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸还参与谷胱甘肽(GSH)的合成。谷胱甘肽代谢与许多细胞反应有关，如细胞抗氧化防御、药物解毒和细胞信号传递。高水平的谷胱甘肽能够提高细胞抗氧化能力，而低水平的谷胱甘肽降低抗氧化能力。一些研究表明，溃疡性结肠炎患者炎症粘膜中的谷胱甘肽显著增加。因此，谷胱甘肽代谢调控对于制定有效的治疗结肠炎策略至关重要。天冬氨酸与结肠炎患者伴随的慢性内脏疼痛和过敏症状有关。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽显示出肠道抗炎特性，通过增加包括三叶因子-3和粘蛋白在内的相关基因的表达而发挥肠屏障保护作用。因此，天冬氨酸可以作为IBD严重程度的指标。色氨酸作为5-羟色胺的前体在肠道中广泛表达。5-羟色胺与结肠炎的发病机制密切相关。在本研究中，还发现结肠组织中色氨酸的水平显著增加，这意味着色氨酸可能是结肠炎的致病介质。除此之外，还发现IBD大鼠次黄嘌呤、肌苷和尿嘧啶的水平发生了变化，它们主要与核苷酸合成有关，并具有抗炎和DNA损伤的作用。IBD患者结肠组织中嘌呤代谢相关基因ILC3和Th17表达与非IBD患者相比发生了改变。因此，次黄嘌呤、肌苷和尿嘧啶可能是潜在的代谢生物标记物。三羧酸循环是通过氧化葡萄糖而为机体供能的主要来源。当葡萄糖不足时，酮体被用作替代能源。DSS组大鼠血中3-羟丁酸和柠檬酸浓度升高，提示DSS诱导的结肠炎大鼠对能量需求较高。同样，临床研究也发现溃疡性结肠炎患者的TCA循环相关分子水平发生了显著变化，表明这些分子可能是结肠炎的潜在诊断生物标志物。为了深入了解IBD的病理生理机制，未来的研究应该集中在代谢、基因表达和蛋白质数据上。本研究目前有一定局限性，一是只使用了GC-MS单一技术进行代谢组学分析。因此，未来需要结合需要多组学或其他技术，如LC-MS，来进一步证实这些发现；此外，小肠组织的代谢组学数据不包括在此研究中。虽然溃疡性结肠炎通常发生在结肠，但比较整个肠道组织不同部位的代谢差异是有生物意义的。未来的研究需要着眼于探索整个肠道的不同部位代谢变化，从而对IBD发病机制更加完善地理解。

结论

本研究利用GC-MS技术，鉴定了DSS诱导的结肠炎大鼠关键靶组织中的差异代谢物。DSS处理组大鼠的氨基酸代谢谱与对照组明显不同，提示氨基酸改变可能与结肠炎发病机制有关。某些氨基酸可能为IBD患者的潜在生物标志物。本研究将有助于确定这些氨基酸在IBD发病机制中的作用，并确定未来的新治疗手段。此外，这些代谢物中的一些可能是微生物代谢物，这表明肠道菌群可能是未来的治疗靶点。进一步研究应注意机体代谢变化、肠道菌群改变与IBD发病机制之间的关系。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34239317/

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