综述|植物DNA去甲基化的最新研究总结（主要由朱健康研究组完成）（一）

iNature：朱健康研究组已经在拟南芥中开发了独特的TGS系统，当细胞的ROS1（沉默抑制因子）因子被突变时，其中活性转基因（RD29A启动子:: LUC报告基因）和同源内源基因（内源性RD29A基因）变得沉默。 ROS1编码5-甲基胞嘧啶特异性DNA糖基化酶/裂解酶，其通过碱基切除修复途径的活性DNA去甲基化来防止整个基因组中的同源基因和其他基因的高甲基化。 ROS3编码一种单链RNA结合蛋白，也可以预防DNA超甲基化。最近，朱健康组报道了另一个活性DNA脱甲基调节因子IDM1，其读取多个表观遗传标记（DNA甲基化，未甲基化H3K4和H3R2）并产生新的表观遗传标记（组蛋白H3K18和H3K23乙酰化），以将DNA去甲基化机制吸引到选定的基因组位点防止其高甲基化和转录沉默。随着技术的发展，对于ROS1怎么募集，有了新的认识，尤其是现在发现IDM1/2/3/HDP1/HDP2/MBD7可以形成复合体，来调节ROS1的去甲基化作用。

DNA甲基化，组蛋白修饰和组蛋白变异引起的表观遗传变化对于调控发育和环境线索的染色质结构，基因组稳定性和基因表达至关重要。在几个系统中，小的非编码RNA可以通过引导序列特异性DNA甲基化（RNA指导的DNA甲基化，RdDM）和/或异染色组蛋白修饰来引导转录基因沉默（TGS）。 DNA甲基化状态由甲基化和去甲基化反应决定。通过甲基转移酶起作用的DNA甲基化，siRNAs和组蛋白修饰模式之间的相互作用已被广泛研究。相比之下，活性DNA去甲基化的机理及其与非编码RNA和组蛋白修饰的关系了解甚少。在植物中的DNA活性去甲基化化过程，朱健康研究组做了很多奠基性的工作，如RD29-LUC系统的开发，ROS1去甲基化酶的发现，ROS3及IDM1的鉴定等待，由于内容比较多，先介绍其中的一部分（RD29-LUC系统的开发，ROS1去甲基化酶的发现，ROS3及IDM1），之后介绍剩余的部分。

1TGS系统的开发-RD29A-LUC系统

为了在遗传上解剖渗透胁迫和冷胁迫信号的复杂网络，朱健康组构建了适应低温，干旱，盐度和植物激素脱落酸（ABA）的生物发光显示的拟南芥植物系。

这通过在拟南芥植物中引入由在胁迫响应性RD29A启动子控制下的萤火虫荧光素酶编码序列（LUC）组成的嵌合基因构建体来实现。通过使用体内发光成像评估转基因植物中的LUC活性，忠实地报道了内源性的表达RD29A基因。通过使用高通量发光成像系统鉴定了大量的cos（渗透应答结构性表达基因），los（渗透应答低表达基因）和hos（渗透应答高表达表达基因）突变体。根据他们对应激和ABA信号之一或组合的反应中的缺陷，将los和hos突变体分组为14个类别。根据恢复的突变种类，提出了高等植物应激信号的模型。

图.1处理条件

在这篇文章，确定了什么样的条件进行筛选突变体，如使用300mmol的NaCl过夜4°C冷处理突变体，这样的效果非常的好，同时也使用ABA效果也不错（图.1）。

图.2筛选突变体流程

另外，经过朱健康组的一些研究员反复的摸索，得出了怎么筛选突变体流程，经过这样的努力，才有后续的一系列成果（图.2）。

图.3筛选到部分突变体

通过这个系统，朱健康研究组筛选到了很多的突变体，但很多都是设计stress（图.3）。

RD29A-LUC系统的初衷是为了筛选渗透胁迫相关的基因，但凡事总是会出现意外，这个系统的转机就在2002年，巩志忠使用这个系统筛到了DNA去甲基化酶ROS1。

2DNA去甲基化酶ROS1的鉴定

巩志忠使用这个系统筛到了DNA去甲基化酶ROS1，其成果发表在Cell上，这也是在植物中第一次提出DNA去甲基化酶，意义非常的重大。另外，ROS1能发在Cell上，也为后续的发现奠定了基础。

图.4 ROS1突变体的表型

巩志忠通过在1997年Plant Cell已经验证过的系统，进行正向筛选突变体，发现ROS1的俩个allele出现了相同的性状，即LUC变暗以及对Kana霉素很敏感，通过Northern blot方法，验证了其生理学表型（看LUC，NPT II及胁迫相关的基因的表达）（图.4）

图.5 图位克隆鉴定ROS1

通过图位克隆，发现ROS1是一个预测的DNA糖基化酶（图.5）,但具体是不是，还不好说，故需要用实验进一步验证。

图.6 ROS1是一个DNA去甲基化酶

通过体外验证，发现ROS1具有DNA糖基化酶的活性，故也验证了上面的假说，这也是第一次在植物里面提出ROS1是一个DNA去甲基化酶（图.6）

3RPA2A及ROS3的发现

通过在正向遗传，巩志忠研究组通过在ros1-1的背景下，拿到了RPA2A基因，这个突变体能够释放ros1的kana敏感性，也就是说，在rpa2aros1-1双突背景下，这突变体可以在kana抗生素下生长（图.7）。

图7.RPA2A可以释放ros1突变体的TGS作用（NPTII基因）

通过生化分析，巩志忠认为，ROS1可以被RPA2A募集到复制叉中，进而执行其去甲基化功能，但是，实际上是不是这样，这里的证据不是很充分，只是通过简单的酵母双杂，BiFC验证，很难让人信服这个结论的准确性，虽然在人类中，RPA2A是复制叉的一个重要成分（图.8）。

图8.RPA2A同ROS1相互作用

同时在，朱健康组，其中的博士后Zheng等人，进行筛选突变体，得到了一个同ROS1突变体一样表型的突变体，将其命名为ROS3（（图.9）

图9.ROS3的筛选

很有趣，ROS3是一个RNA结合蛋白，通过体外实验，验证了ROS3的确是一个RNA结合蛋白（图.10）

图10.ROS3是一个RNA结合蛋白

通过共定位，发现ROS3可以同ROS1定位在细胞核（图.11），这就提出了潜在的机制，说ROS3可以协助ROS1的去甲基化功能，但这比较牵强，这没有直接的相互作用，很难说明ROS3是怎么与ROS1扯上关系的，到现在，ROS3怎么起作用，仍然是一个迷。

图11.ROS3与ROS1共定位

4IDM1的鉴定

由于使用RD29A-LUC系统中的LUC标记基因去筛选突变体，遇到了瓶颈，很难在筛选到DNA去甲基化的突变体，故朱健康组使用了DNA甲基化敏感的限制性内切酶技术（Chop-PCR）及35S-SUC2系统，筛选到了IDM1，其中的成果发表在Science上，这个工作主要由钱伟强博士后完成。

虽然使用Chop-PCR能够筛选到IDM1突变体，其实前期有雷明光博士后的35S-SUC2系统进行验证的，只是这篇文章着重阐述Chop-PCR方法而已。使用Chop-PCR筛选，获得了2个IDM1突变体allele，它们呈现了ros1-4一样的表型，也就是在pm36这个位点高甲基化模式（图.12）。

图12.idm1在Pm36呈现高甲基化状态

通过蛋白质结构预定额分析，可以知道，IDM1蛋白包含PHD结构域，HAT（乙酰转移酶的结构域），MBD结构域（图.13），通过生物化学分析及遗传学实验分析，可知这些结构域都有相应的功能，对于任何的一个结构域，IDM1行使功能都是必须的。

图13.IDM1含有的结构域

通过全基因组学甲基化测序，发现IDM1突变体同ros1-4的hyper-DMR很大部分都是重叠的，说明IDM1同ROS1在遗传学上可能处于同一途径（图.14）。

图14.idm1甲基化分析

经过相应的实验验证，最后，提出了IDM1怎么募集ROS1的模型，但是，在这个模型里面，有很多的问题没有解决，如ROS1具体是怎么样被募集的，IDM1的hyper-DMR那么少，那其他的ROS1的hyper-DMR是怎么产生的，还是一个疑问。

图15.IDM1募集ROS1模型

几乎在同时，巩志忠课题组使用RD29A-LUC系统，筛选到了IDM1突变体，其论文发表在PNAS上。

后面也提出了类似的model，俩者区别不是很大（图.16）。

图16.使用RD29-LUC系统筛选到IDM1（NPTII标记基因）

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参考文献

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