PCR技术-引物设计和实验技巧
PCR引物设计
PCR引物设计的基本原则
1. 引物的长度：最适合的引物长度为18～30个碱基；
2. 引物的Tm：最适合的Tm范围是55～60℃，在一个PCR反应中所使用的引物的Tm应该相似，一对引物的Tm的差别不能大于2～3℃；
3. 引物的二级结构，避免出现自我同源区而形成发卡结构，选择具有50%GC含量和缺少4种碱基中一种的引物可以有效解决自我配对；
4. 设计引物要避免一长串单一碱基或核苷酸重复；
5. 在引物的3'端含有一个G或C残基能增加引物的特异性；
6. 对于扩增富含GC的DNA片段，推荐用较高Tm的引物 (75～80℃)；
7. 引物设计好之后，引物序列要用BLAST进行检查，检测是否与基因组中重复序列或其它基因位点有交叉同源；
8. 一对引物之间不能有连续4个碱基互补，引物末端应无回文区；
9. 自由能：反映了引物与模板结合的强弱程度，一般情况下，引物的自由能最好呈正弦曲线形状，即5'端和中间较高，而3'端较低，3'端的自由能在0～-2kcal/mol最好。
引物的纯度
1. OPC纯化：
使用反向层析柱对DNA进行纯化，得到的DNA纯度大于90%，适用于40mer以下引物的纯化，得到的引物可以用于普通PCR、测序或作为探针；
2. PAGE纯化：
使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA进行分离纯化，得到的DNA纯度大于95%，可以对大于50mer的DNA进行纯化，得到的引物可以用于普通PCR、测序、定量PCR、点突变、RNA干扰等，用于定量PCR的引物至少要达到PAGE级；
3. HPLC纯化：
使用高效液相色谱对DNA进行分离纯化，得到的DNA纯度可以大于99%，主要用于修饰引物的纯化、基因重组、定点突变等要求较高的基因工程技术。
PCR的结果
使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应的产物，以确定PCR反应是否成功。
理想的PCR结果
成功的PCR反应只能检测到一条大小与目的片段一致的条带。
引物二聚体
有些PCR反应，会由于扩增效率较低或者引物量过多而产生引物二聚体，表现为在100bp以下的一条较暗的条带。
如果实验的目的只是定性检测样品中是否存在目的基因，那么引物二聚体对实验结果并无影响。
如果后续的实验需要对PCR的产物进行测序或克隆，可以减少引物投加量的方式消除引物二聚体，或者采用切胶回收的方法纯化PCR产物。
非特异性扩增
当琼脂糖凝胶电泳中出现除了目的条带以外的其它条带时，即表明该PCR反应存在非特异性扩增。
如果非特异性扩增条带很少，并且其亮度也比较低，可以采用提高退火温度的方式消除非特异性扩增。
如果非特异性扩增条带很多，或者提高退火温度后依然存在非特异性扩增，建议重新设计引物进行PCR实验。
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