金担子素A/AureobasidinA

Coolaber-金担子素

金担子素A/AureobasidinA

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不溶于水，

溶于甲醇、乙醇

一、关于AbA（CA2332）：

金担子素A（Aureobasidin A，AbA）是从丝状真菌Aureobasidium pullulans No. R106中分离出来的环酯肽类抗生素，具有很强的抗真菌能力。AbA作用机制是抑制酵母中AUR1基因（1，2）编码的肌醇磷酰胺（inositolphosphorylceramide，IPC）合成酶的活性，干扰鞘脂合成，从而杀死菌株。AbA在较低的浓度下（0.1-0.5 μg/mL）即可对酵母产生毒性。编码IPC合成酶的基因研究较多的来自酿酒酵母菌的AUR1基因，以及构巢曲霉的AURA基因，两者具有同源性。通过对编码AUR1-C基因进行突变即可使得菌株对AbA产生抗性，作为蛋白质互作研究的报告基因。

因为AbA可以直接杀死敏感的酵母菌株，而不是延迟菌株生长，所以AbA筛选有利于阳性克隆的生长和识别。与营养报告基因（如HIS3）进行的低严紧度初筛相比，AbA筛选大大消除了背景克隆。实际操作中，用AbA进行初筛时会获得更多克隆，之后再用4个报告子(AUR1-C，HIS3，ADE2和MEL1)进行高严紧度的二次筛选以验证阳性克隆。AbA非常适合用作阳性克隆子筛选用的药物选择性标记；也是酵母单/双杂交研究中理想的报告子，可以简化酵母双杂交文库筛选。

二、使用方法：

     1、本品为AbA的甲醇溶液，浓度为1 mg/mL，直接用作储存液。

      2、灭菌后YPD Agar培养基（PM2020）冷却至50-55 ℃，加入适量的AbA储液，倒板备用。（AbA工作浓度取决于宿主细胞的敏感度，见下表） 

       3、制备酵母感受态细胞并完成转化，参考SK2400，SK2401。

       4、把100 μl完成转化酵母细胞悬液涂到含有适量AbA的YPD Agar培养基平板上，30℃培养2-4天。

        5、挑取克隆鉴定，或统计转化效率。

三、不同菌株建议AbA的工作浓度：

菌株	MIC（µg/mL）
S.cerevisiae	ATCC9763（diploid）	0.2-0.4
Baker’s yeast（diploid）	0.2-0.4
Beer yeast（triploid or tetraploid）	0.1
SH3328（haploid）	0.1
Shochu yeast（diploid）	0.1
Sake yeast（diploid）	0.1-0.2
C.albicans	TIMM-0136（diploid）	0.04
C.tropicalis	TIMM-0324（diploid）	0.08
Schizo.pombe	JY-745（monoploid）	0.1

四、对AbA敏感的真菌：

出牙酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、光滑念珠菌（Candida glabrata）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和黑曲霉（A. niger.）。

五、酵母双杂交报告基因筛选：

AUR1-C是AUR1 的突变体，编码肌醇磷酸化酰胺合成酶，表达产物可以使酵母菌对金担子素产生抗性，只有产生蛋白互作的时候才会被激活，以此来筛选互作蛋白。Y2Hgold的报告基因之一为AUR1-C，可以用金担子素来筛选互作蛋白，比用组氨酸缺陷（HIS3）培养基筛选背景更低（更少的假阳性）。用于筛选的金担子素常用的浓度范围0.1-0.5 µg/mL。如筛选出来阳性克隆太少，可以将金担子素从200 ng/mL降低至150 ng/mL或者125 ng/mL。

六、酵母单杂交筛选：

如酵母单杂用的载体为pAbAi，诱饵序列克隆到pAbAi载体形成pBait-AbAi，通过同源重组整合到Y1Hgold基因组上，当猎物蛋白与诱饵蛋白发生互作后，会激活重组酵母菌AbAr基因的表达，使酵母菌对金担子素产生抗性，以此来筛选互作蛋白。重组酵母菌会有低背景的AbAr的本底表达，而且不同的诱饵蛋白表达程度也不一样。需要筛选出可以抑制本底表达的最低金担子素的浓度，用于后续阳性克隆筛选。一般会先用100 ng/mL，150 ng/mL，200 ng/mL的金担子素筛选约2000个细胞（OD600值稀释到0.002后取100 µL图板）。金担子素浓度最高可加到1 µg/mL。如还不能抑制本底表达，那诱饵蛋白不能用于金担子素筛选的互作实验。