【期刊发表】特瑞普利单抗是不依赖于糖基化修饰与PD-1的FG环结合的单克隆抗体
作为国内首个获得NMPA批准成功上市的抗PD-1单抗产品，特瑞普利单抗的结合特点也一直被广大肿瘤临床医生所关注。近期，特瑞普利单抗研究团队在国外期刊mAbs (IF：5.165）上发表了关于其结构和结合特点的文章，确定了特瑞普利单抗和PD-1的复合体结构，阐释特瑞普利单抗与PD-1相互作用的结构基础，同时研究者也针对特瑞普利单抗与PD-1的糖基化修饰可能存在的3个潜在N-键糖基化位点的结合进行了研究。
以单克隆抗体（mAb）（后面简称为“单抗”）为基础的免疫检查点治疗（ICT），可阻断免疫检查点受体与配体的相互作用，重新刺激抗肿瘤T细胞免疫，用于肿瘤免疫治疗，目前已得到了大家的关注。程序性细胞死亡1（PD-1）作为调节T细胞反应性的关键抑制分子，在肿瘤微环境中发挥着关键的免疫抑制作用；因此，通过阻断PD-1与其配体PD-L1之间的相互作用，阻断T细胞内的抑制信号，可以释放T细胞固有的抗肿瘤活性，从而杀死肿瘤细胞。
此前，有研究者报告了阻断PD-1/PD-L1相互作用的单抗与目标结合的结构基础，这有助于我们了解这些单抗的阻断机制及不同的结合特性。令人意外的是，纳武利尤单抗主要结合于PD-1的N端环，该结构在有助与PD-L1结合的免疫球蛋白样结构域之外。此外，帕博利珠单抗与PD-1的柔顺性C'D环结合，该结构也不涉及与PD-L1的相互作用。尽管这两种单抗靶向作用于PD-1，但他们通过与PD-1的不同区域部位结合而阻断PD-1/PD-L1的相互作用，并通过其各自独特的立体结构竞争性结合至PD-1。此外，也曾有研究者报道了以PD-L1为靶点，阻断PD-1/PD-L1结合的纳米抗体。然而，这些是否代表所有阻断PD-1/PD-L1相互作用单抗的结合模式尚不清楚。在临床研究中更多的单抗以PD-1/PD-L1为作用靶点，研究这些单抗的结合机制可以更好地理解阻断PD-1/PD-L1相互作用的单抗在肿瘤免疫检查点疗法中的应用。
PD-1或PD-L1的糖基化修饰以及这些糖基化对与治疗性单抗相互作用的影响是该领域关注的问题。PD-1和PD-L1均存在糖基化修饰，尤其是PD-1存在高度糖基化。近期有报道指出，PD-L1的糖基化修饰影响治疗性单抗与PD-1的相互作用，以及其后的免疫抑制作用。然而，对于单抗与PD-1结合机制的结构基础以及PD-1糖基化修饰的影响仍不清楚。
在本篇文章中，研究者针对特瑞普利单抗的结构和结合都进行了详细的阐述。下面，我们将从以下5各方面为您介绍特瑞普利单抗的结合特点。
01
特瑞普利单抗靶向作用于PD-1抑制肿瘤
采用蛋白酶联免疫吸附法或细胞流式细胞术的检测结果表明，特瑞普利单抗可以阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的相互作用，且对PD-1/PD-L1的阻断作用高于PD-1/PD-L2（图1-A、图1-B）。
将MC38接种于人源化PD-1敲入的C57BL/6小鼠体内，从MC38肿瘤接种后第7天（D7）开始，每隔3或4天通过腹腔注射（I.P.）给予特瑞普利单抗。在注射特瑞普利单抗或对照单抗后，每隔3或4天监测肿瘤大小。生理盐水和对照单抗作为阴性对照（图1-C）。
对7天内皮下可触及肿瘤的MC38小鼠进行静脉注射特瑞普利单抗，共包括4种给药剂量：0.3 mg/kg、1 mg/kg、3mg/kg和10 mg/kg，或生理盐水或对照IgG。结果显示，在MC38肿瘤模型中，特瑞普利单抗的EC50剂量范围可能为0.3 mg/kg-1 mg/kg。靶向PD-1的特瑞普利单抗呈现出显著的肿瘤抑制效果，且具有剂量依赖性（图1-D）。
图1.特瑞普利单抗在MC38小鼠模型中的抗肿瘤作用
02
PD-1的FG环支配与特瑞普利单抗的结合
在筛选特瑞普利单抗-抗原结合片段（Fab）/PD-1复合体蛋白晶体后，以2.6Å的分辨率解析了特瑞普利单抗与PD-1的复合体结构（图2）。特瑞普利单抗与PD-1的结合总面积为2011 Å，而H链和轻（L）链与PD-1的结合面积相当，分别为961 Å和1049 Å。总体而言，特瑞普利单抗重链（HCDRs）的三个CDR均参与了与PD-1的相互作用，而其轻链的CDR1和CDR3（LCDR1和LCDR3）参与其中。特瑞普利单抗主要通过HCDR3和LCDR1与PD-1结合，主要部位为PD-1的FG环，形成多氢键相互作用。
特瑞普利单抗具有一个较长的含有18个氨基酸的HCDR3环，与PD-1的FG环形成多重结合。HCDR3的氨基酸（E99、T102、Y108、W110和Y111）与来自PD-1的FG环（P130、K131、A132和I134）氨基酸形成主要氢键相互作用（图2）。特瑞普利单抗LCDR1的H31也与FG回路的P130形成氢键相互作用。此外，来自HCDR1、HCDR2和LCDR1的氨基酸与PD-1的FG环结合，通过范德华力相互作用。
图2. 特瑞普利单抗在MC38小鼠模型中的抗肿瘤作用
03
特瑞普利单抗通过与PD-L1竞争性结合PD-1而阻断PD-1/PD-L1的相互作用
与PD-L1相比，特瑞普利单抗与PD-1的结合表现为立体特异性结构。特瑞普利单抗的H链与PD-L1具有竞争性作用，而L链则远离PD-1/PD-L1的结合面（图3A）。与PD-L1的结合面相比，针对PD-1上特瑞普利单抗结合面的进一步分析显示，重叠结合面主要位于FG环（P130、K131、A132、I134），即也是特瑞普利单抗的主要结合靶点（图3B）。研究表明，特瑞普利单抗主要是通过H链衍生体与PD-1的结合，从而阻断PD-1与PD-L1的结合（图3）。
图3. 特瑞普利单抗与PD-L1竞争性结合PD-1
04
特瑞普利单抗与PD-1的结合不依赖于糖基化修饰
对PD-1的结构分析表明，在N-糖基化位点中，N49、N58、N116三个位点均可观察到糖基化修饰（图4A）。
采用芯片上固定有特瑞普利单抗的表面等离子体共振（SPR）分析了293T或大肠杆菌表达系统中特瑞普利单抗与PD-1蛋白的结合情况。结果表明，特瑞普利单抗与大肠杆菌PD-1蛋白的结合亲和力（KD）（KD=0.324 nm）与293T细胞（KD=0.238 nm）无明显差异（图4B、4C）。该结果表明，特瑞普利单抗与PD-1的结合不依赖于任何糖基化修饰。
图4. 特瑞普利单抗与PD-1结合不依赖于糖基化修饰
05
不同靶向PD-1的单抗具有不同的结合方向
来自PD-L1、纳武利尤单抗或帕博利珠单抗复合体中的PD-1与特瑞普利单抗/PD-1复合体中的PD-1存在叠加（图5A）。这些单抗主要结合在PD-1环上。帕博利珠单抗主要结合在C’D环，而纳武利尤单抗主要结合在N-端环；特瑞普利单抗主要结合在FG环（图2B、5A）。这些发现表明，PD-1的FG环以不同的构象与不同的单抗结合（图5B）。比较分析表明，特瑞普利单抗与PD-1的结合方向与纳武利尤单抗相似，而与帕博利珠单抗具有不同的结合方向（图5C）。
尽管在特瑞普利单抗和纳武利尤单抗之间观察到相似的结合方向，但这两种单抗与PD-1的主要结合区域存在较大差异。这些结果表明，靶向PD-1的治疗性单抗采用不同的结合模式来阻断PD-1与PD-L1的相互作用。
图5. 特瑞普利单抗PD-1的聚糖修饰和的糖基化独立结合
肿瘤细胞中蛋白糖基化修饰紊乱在多种肿瘤的发生和进展中发挥着关键作用。PD-1蛋白存在高度糖基化，所有4个潜在的N-连接糖基化位点均存在糖基化。据报道，肿瘤细胞固有的PD-1的表达在促进肿瘤生长中发挥着关键作用，靶向肿瘤细胞固有PD-1的单抗可显著降低肿瘤进展。因此，PD-1特异性单抗不仅能刺激衰竭型T细胞，诱导抗肿瘤免疫，而且通过直接靶向肿瘤细胞固有PD-1而抑制肿瘤生长。肿瘤细胞中的糖基转移酶表达失调引起了人们的关注，即肿瘤细胞中PD-1糖基化修饰紊乱可能影响PD-1特异性单抗的结合效率，进而影响治疗效果。本文报道的在293T细胞中表达的PD-1结构表明，4个N-键糖基中的3个可以观察到糖基化修饰。
N-键糖基化位点主要位于PD-1环上，即BC环（N58）、CC'环（N74）和EF环（N116），B链起始处的N49除外。正如本文研究小组和其他研究者先前报告的那样，PD-1的所有可见糖基化修饰均远离PD-1/PD-L1的结合面，PD-1与PD-L1的结合不受这些糖基化的直接影响。然而，Li等近期报道，PD-L1的N-键糖基化会影响PD-1和PD-L1之间的结合，这表明糖基化修饰可能参与调节PD-1信号传导。使用SPR分析评估特瑞普利单抗与完全糖基化或非糖基化的PD-1蛋白的结合亲和力，未观察到明显差异，表明特瑞普利单抗与PD-1结合独立于糖基化修饰。因此，特瑞普利单抗的临床应用不太可能受到PD-1糖基化修饰失调的影响。
本文的结构分析表明，特瑞普利单抗与PD-1的结合给PD-L1与PD-1的结合带来了立体结构障碍，重叠的结合面表明了两者存在与PD-1的竞争性结合。该研究发现特瑞普利单抗与PD-1的结合主要位于FG环上，该环也与PD-L1存在多种相互作用。此外，特瑞普利单抗与PD-1的结合独立于糖基化修饰，这也为我们理解抗肿瘤机制提供了有用的信息，尤其是在肿瘤细胞中的PD-1常伴有糖基化修饰缺陷，当以PD-1为作用靶点时，这一点尤其重要。
特瑞普利单抗结合特点
1特瑞普利单抗具有与PD-1结合的分子学基础
2特瑞普利单抗通过非常规的长HCDR3与PD-1的FG环结合
3特瑞普利单抗与PD-1的结合与PD-1的糖基化修饰无关
我们希望所有这些发现能有助于我们加深理解特瑞普利单抗与PD-1的的结合机制，并拓宽我们对基于单抗的免疫检查点疗法的认知，有利于进一步开发靶向PD-1的生物制剂用于肿瘤免疫治疗。
当然，在结合机制上，特瑞普利单抗仍然是具有高亲和力的和高特异性的抗PD-1单抗药物：
同时，生物学结构稳定和独特的内吞机制也是特瑞普利单抗重要而优秀的特质：
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参考文献
Liu H, et al. Glycosylation-independent binding of monoclonal antibody toripalimab to FG loop of PD-1 for tumor immune checkpoint therapy. MAbs. 2019Mar 20. Doi: 10.1080/19420862.2019.1596513. [Epub ahead of print]
特瑞普利单抗（商品名：拓益，英文名：Toripalimab Injection）是君实生物自主研发的抗PD-1单抗，于2018年12月17日获批上市，用于治疗既往接受全身系统治疗失败的不可切除或转移性黑色素瘤。
目前，特瑞普利单抗在黑色素瘤、鼻咽癌、尿路上皮癌、三阴乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、肾细胞癌、食管鳞癌、头颈部鳞癌、淋巴瘤、神经内分泌瘤等多种疾病领域仍有多项注册临床研究在积极开展中。
审批编号：JSSW20190409079
有效期至：2021年4月8日
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